高温内切纤维素酶突变体晶体结构解析及功能进化关系分析

【摘要】酶催化降解纤维素多聚物为可溶性糖类是生物炼制过程的重要环节，发现高效、稳定纤维素酶酶源，并揭示其结构、功能及进化关系成为已酶学及生物能源相关领域研究的重点。本实验室曾对来源于Caldicellulosiruptorbescii的高温纤维素酶系进行了系统研究，发现重要成员CbCel9A属于糖苷水解酶第九家族（GH9），是双模块、渐进性的内切纤维素酶，它具有热稳定性好、对不溶性纤维素具有较高活性等特点。序列及结构同源性等分析表明，该酶活性中心底物通道的末端存在由19个残基组成的非保守性loop区，其较高的结构柔性及变化的氨基酸组成可能对酶催化功能等有影响。我们对活性中心该loop区进行了删除突变，以阐明loop区对CbCel9A功能的调控作用，通过相关蛋白结构解析及功能进化分析，揭示高温酶催化、稳定性及分子内模块间协同作用机制。本论文主要研究工作如下：(1)CbCel9A突变体功能表征。首先，以两个残基为单位，我们构建了活性中心Loop区N末端递增删除的系列突变体（N2、N4、N6N18删除突变）。截短8个残基的突变体N8的酶学性质改变得最为显著：对结晶纤维素Avicel的活力是野生型CbCel9A的1.91倍；动力学分析表明，突变体N8对底物RAC的Km值降低为原来的61%；水解滤纸的渐进性由5.81增加到11.28；在85℃时半衰期由12h增加到16h。(2)CbCel9A突变体结构分析。在0.2MCalaiumacetatehydratepH6.5,0.1MSodiumcacodylatetrihydrate,10%W/VPolyethyleneglycol8,000结晶条件下，获得2.1分辨率的突变体N8二聚体三维结构；结构分析表明，突变体N8的催化结构域通过由18个氨基酸组成的连接肽与CBM3c模块连接；活性中心裂隙和CBM3c底物结合表面处于同一平面，有利于结构域之间协作结合纤维素底物并进行水解；与已报道的只具有该酶催化结构域（PDB：4DOE）结构相比，突变体Loop区缺失8个残基后，活性中心裂隙的非还原末端由原来封闭状态变得相对开放，扩展了酶活性中心底物结合的空间；而且由于多个极性残基的暴露，扩大了电负性区域，有利于酶与底物分子的结合，这与突变体N8水解底物RAC的Km值降低是一致的；与单独催化结构域（PDB：4DOE）相比，突变体N8催化位点E420羟基氧与催化位点D58羟基氧之间的距离由5.49增加到6.80，有利于糖苷水解酶反转型催化。(3)野生型CbCel9A及突变体N8稳定性的结构基础。野生型CbCel9A及突变体N8的最适反应温度都在80℃以上，而单独的CbCel9A催化结构域的最适反应温度只有50℃，高温条件下不稳定，这表明CBM3c模块对于酶稳定性具有重要影响；结构分析表明，催化结构域与CBM3c模块及连接肽间具有较强的氢键和疏水作用，使双模块形成了具有刚性结构的整体，DSC实验单一突变峰的出现也表明该酶完整结构的整体性。(4)GH9家族活性中心结构与功能进化关系分析。以Thermobifidafusca来源的酶与底物复合物结构（PDB：4TF4）为基础，确定了组成GH9家族糖苷水解酶活性中心结构的27个潜在位点；利用同源模建和多结构比对，计算了125个GH9家族糖苷水解酶活性中心架构中氨基酸组成相对于全蛋白序列背景下的相对变化率，以序列保守性为基准构建了“活性中心架构”序列谱图，并对功能保守位点和部分非保守位点的功能及进化关系等进行初步分析。色氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、组氨酸等在活性中心架构内出现频率较高；潜在的27个位点中，绝对保守位点有7个，分别为D55，A56，D58，W260，H376，R378，E424，其中D58、E420为催化残基，除位于Loop区C末端W260外，其它保守残基都分布在糖类结合位点的-1到+1位点之间，这种由绝对保守氨基酸构成的三维空间框架可能是GH9家族水解酶结合底物及断裂糖苷键的结构基础；同时我们发现，与催化位点D58在序列和空间上靠近的绝对保守位点D55参与底物结合，推测其不仅具有辅助催化功能，而且可能是维持催化过程中-1位点糖环位置和构象正确性的关键；非保守位点H125与催化位点D58通过氢键相互作用，影响D58的电离平衡常数，这可能是影响酶反应最适pH值的重要因素。本论文通过对CbCel9A突变体N8功能及结构关系的系统研究，阐明了双模块酶结构域之间的组织特征，揭示了酶活性中心组成对酶催化、稳定性及底物结合等性质的重要影响；通过生物信息学手段构建了GH9家族糖苷水解酶活性中心架构序列谱图，以上研究对于深入理解纤维素酶的作用机制和开展纤维素酶分子理性设计具有重要的指导意义。
【作者】范园生；
【导师】冯雁；
【作者基本信息】吉林大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】高温纤维素酶；催化活性；稳定性；晶体结构；活性中心架构；

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