抗玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B_1抗体的制备和评价

【摘要】本课题来源为吉林省世行贷款农产品质量安全项目《吉林省优势农产品——玉米汁加工质量安全控制关键技术研究》（2011-Z67）。玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZON）和黄曲霉毒素B1（AflatoxinB1，AFB1）是真菌产生的有毒次级代谢产物，主要存在于粮食、饲料、食品中，尤其常见于保存在潮湿环境下的玉米、玉米饲料及玉米制品中。ZON具有较强的类雌激素作用。AFB1具有强烈的致癌作用。酶联免疫法（Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay，ELISA）较传统分析方法，具有成本低、耗时时间短、快速、灵敏、便于基层检测部门检测的特点，成为目前毒素检测发展的方向。而制备高灵敏性、强特异性的抗体则是建立毒素ELISA检测试剂盒的关键。本文采用乙二胺-EDC法制备阳离子化偶联蛋白，分别采用DCC-NHS活性酯法、曼尼希法、AFB2a法制备相应ZON和AFB1的完全抗原，并采用紫外、薄层层析、电泳、TNBS等技术对中间产物和完全抗原进行了性质分析和鉴定。利用制备的ZONO-BSA和AFB2a-cBSA免疫小鼠，制备小鼠的多抗血清，采用间接ELISA和间接竞争ELISA方法对血清进行评价分析。同时，免疫ZONO-BSA的小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合，制备ZON单克隆抗体。采用间接ELISA和间接竞争ELISA方法对抗体的效价、灵敏度、检测限进行了评定。最后，参考国标，使用高效液相色谱法检测AFB1，验证方法的回收率等参数，并比对前面建立的ic-ELISA方法。具体研究内容如下：(1)阳离子化蛋白的制备，该研究采用乙二胺-EDC法制备阳离子化牛血清蛋白（cBSA）和阳离子化鸡卵清蛋白（cOVA）。(2)ZON抗原的制备，采用DCC-NHS活性酯二步法构建ZON完全抗原。根据紫外检测结果，可初步判断，ZON完全抗原制备成功。TNBS法测得偶联结合比nZONO:nBSA=12.7:1、nZONO:nOVA=6.6:1。(3)AFB1完全抗原的制备，选用两种方法制备AFB1的完全抗原，分别为AFB2a法、曼尼希法。AFB2a法制备得到AFB2a-cBSA和AFB2a-cOVA。曼尼希法制备得到AFB1-cBSA和AFB1-cOVA。根据紫外检测结果，可初步判断，AFB2a法制备AFB1完全抗原成功。TNBS法测得偶联结合比nAFB1:ncBSA=14.32:1、nAFB1:ncOVA=7.45:1。(4)抗ZON抗血清的制备和评价，选择ZONO-BSA作为免疫抗原免疫小鼠，间接ELISA测定小鼠血清的效价。ELISA结果显示，小鼠的效价均呈现较高的水平，最高可达1:64000。间接竞争ELISA测得抗血清的IC50为74.69ng/mL，检测限为23.24ng/mL。(5)抗AFB1抗血清的制备和评价，选择AFB2a-cBSA作为免疫抗原免疫小鼠，间接ELISA结果显示，小鼠的效价均呈现较高的水平，最高可达1:256000。间接竞争ELISA测得抗血清的IC50为90.00ng/mL，检测限为29.16ng/mL。(6)ZON单克隆抗体的制备和评价，选择ZONO-BSA作为免疫抗原免疫小鼠。免疫程序结束后，取脾，进行细胞融合，筛选出阳性杂交瘤细胞FG2。制备并纯化腹水。间接ELISA结果显示，单抗的效价为1:1024000。间接竞争ELISA测得单抗的IC50为9.21ng/mL，检测限为2.78ng/mL。(7)HPLC检测AFB1，建立HPLC检测AFB1的方法，并得到标准曲线，本方法标准曲线的回归方程为S=63187.94859*C+85195.63562，相关系数R2为0.99237，线性关系良好。加标回收试验表明，使用该法检测黄曲霉毒素B1，平均回收率为89.32%，相对标准偏差RSD为3.83%。选用HPLC法和建立的AFB1多抗血清的间接竞争ELISA方法进行比对，相关系数为0.83，需具有较高的相符性。
【作者】陈晓飞；
【导师】刘静波；
【作者基本信息】吉林大学，食品科学，2014，硕士
【关键词】玉米赤霉烯酮；黄曲霉毒素B1；酶联免疫；抗原制备；抗血清；单克隆抗体；

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