褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）和杂交鲆（P.olivaceus♀×P.dentatus♂）幼鱼高温耐受性研究

【摘要】温度是影响鱼类存活、摄食、生长、发育、繁殖等过程的重要环境因子。鱼类对温度的耐受能力决定了其时空分布范围。随着全球气候变化和极端气象的频发，水生生物的耐热性研究及耐热品种的培育具有非常重要的研究意义和生产价值。然而，有关海水鱼类的耐热性研究还十分有限，耐热性指标也尚无统一的可靠标准。褐牙鲆（ParalichthysolivaceusTemminck&Schlegel，1846）是我国重要的海水养殖鱼类，具有较高的经济价值，养殖区域也不断南移。但受到夏季高温期死亡频发的影响，其养殖产业屡受损失。大西洋牙鲆（ParalichthysdentatusL.，1766）是大西洋海岸的重要渔获种，具有更好的高温耐受性。两者的杂交子一代P.olivaceus×P.dentatus（以下简称杂交鲆）继承了亲本优良的经济性状，同时表现出生长快、耐高温的特性。为了比较高温对褐牙鲆和杂交鲆的影响，阐明杂交鲆优于亲本的耐热性状，同时丰富海水鱼类耐热性研究，充实种间杂交遗传理论，为相关耐热性育种研究提供一定的理论基础，我们从组织水平、生理生化和hsp70基因表达量的水平研究了高温对褐牙鲆各个组织的结构、超氧化物歧化酶（SOD）、还原型谷胱甘肽（GSH）、溶菌酶（LZM）、丙酮酸激酶（PK）的相对活力（相对含量）和hsp70基因表达量的影响。研究了不同升温模式下，褐牙鲆和杂交鲆鳃组织结构的变化，SOD、过氧化氢酶（CAT）、GSH、LZM和PK相对活力的变化，以及hsp70基因表达量的变化差异。同时还克隆、比较了褐牙鲆、大西洋牙鲆、杂交鲆hsp70/hsp90基因的cDNA序列，对29℃下三者的SOD、GSH、LZM和PK相对活力，以及hsp70/hsc70/hsp90基因的相对表达量变化进行了比较。主要研究结果如下：1)褐牙鲆不同组织对高温（32℃）的响应程度不同。肝、肾和鳃组织的结构在高温下出现了一系列的变化，如组织水肿、上皮位移或破裂、细胞坏死等。与氧化应激、免疫反应和能量代谢相关的酶活力检测发现，褐牙鲆的肝组织中SOD、GSH和LZM都有相对较高的表达。高温热胁迫下，不同组织的hsp70表达量随着时间的推移都表现出相似的变化趋势：先升高后下降。我们发现hsp70表达量达到峰值的时间大致有两个：2h和6h，并依据这个特点，把研究的组织分为两组，2h组包括脾、肝、鳃和肾，6h组包括肠、胃、肌、心和脑。通过各个组织hsp70表达量差异的横向比较，发现对照组中脑和鳃是hsp70表达较丰富的组织，高温胁迫条件下，肝、鳃和肌是hsp70表达量升高最显著的组织，分别对应1h、2h和6h（及12h）。值得注意的是，在组织学研究中表现出最多症状的组织（肝、肾和鳃）都在2h达到hsp70表达量的峰值，其中的肝和鳃的hsp70表达量变化尤为显著，且肝组织中酶的相对活力变化也较显著。由此我们提出，鳃和肝是研究高温对海水鱼类影响时理想的备选组织，相关的结论也为后续的研究工作提供了理论依据。2)慢性升温模式下，褐牙鲆在29℃和32℃时累计存活率显著低于杂交鲆；其鳃组织在高温下破坏严重；与氧化应激、免疫反应及能量代谢相关的酶（SOD、CAT、LZM和PK）的相对活力波动剧烈，在29℃和32℃附近基本都发生下降；hsp70基因表达量也在29℃和32℃时显著升高，且上调幅度显著高于杂交鲆，与这两个温度下的死亡爆发和组织损伤相对应。我们的研究发现，褐牙鲆对29℃和32℃的高温更敏感。相比之下，杂交鲆的累计存活率更高，在高温胁迫下其鳃组织的结构也相对保持得更完整，酶的相对活力变化不显著，hsp70的表达上调得更晚，上调幅度相对低于褐牙鲆，且在29℃后有适应后回落的趋势。这些结果都反应了其对高温可能具有更好的耐受性。至此我们总结并提出，高温不耐受种对高温的敏感性在多个层面都有所表现，如高死亡率、组织结构的严重破坏、酶活力的剧烈变化、hsp70基因的首先响应和大幅上调。与之对应的就是耐高温种在升温过程中于各个层次表现出的相对优势和稳定性。3)通过不同温度梯度（26、29和32℃）的急性升温模式实验我们发现：杂交鲆的累计存活率均高于褐牙鲆，在极端高温32℃下其死亡的发生（4h）和死亡的爆发（12h）均晚于褐牙鲆（1.5h，4h）；其鳃的结构相对保持得更完整，而褐牙鲆鳃的呼吸表面的破坏更严重；SOD、GSH、LZM和PK相对活力的变化基本反映了褐牙鲆和杂交鲆在极端高温（32℃）下，抗氧化能力和机体的免疫防御能力下降，同时伴随着能量支出的增加；两者的hsp70表达量在热刺激后0.5h就检测到显著升高，相比之下，褐牙鲆hsp70基因的表达量变化比杂交鲆更剧烈和持久，具体表现在更快的hsp70响应速度和更高的响应强度，以及更慢的回落速度。我们发现，急性升温模式和慢性升温模式所得结果具有一致性，反应了杂交鲆更好的耐热性，但两者相比，在慢性升温模式下杂交鲆的耐热性优势更明显。4)通过克隆褐牙鲆、大西洋牙鲆和杂交鲆hsp70和hsp90基因cDNA全序列及序列分析发现，三者的hsp70/hsp90基因高度保守，克隆所得的hsp90序列更接近hsp90-β。通过29℃热胁迫条件下，褐牙鲆、大西洋牙鲆和杂交鲆有关氧化应激、免疫反应和能量代谢的酶的相对活力研究和分子水平的研究发现：随着热胁迫时间的增长，SOD、GSH、LZM和PK的相对活力都发生了一系列的变化，且三者的变化趋势大致相同。尤其在SOD、LZM中的变化趋势较明显，变化曲线呈“M”型，类似于慢性升温模式下SOD和LZM的变化趋势。褐牙鲆、大西洋牙鲆和杂交鲆的hsp70/hsc70/hsp90基因表达量随着热胁迫时间的增长都发生了变化，hsp70基因表达量先升高后下降，而hsc70/hsp90基因表达量变化曲线呈“M”型，且hsc70/hsp90基因表达量变化的剧烈程度明显低于hsp70。结合前文慢性升温模式和急性升温模式的研究结论，我们认为hsp70是海水鱼类耐热性研究中较理想的指标。
【作者】柳意樊；
【导师】李军；
【作者基本信息】中国科学院研究生院（海洋研究所），水产养殖，2014，博士
【关键词】褐牙鲆（Paralichthys；olivaceus）；杂交鲆；耐热性；组织学；酶活；hsp70；

【参考文献】
[1]张晓艳,李浩鹏,崔晓莉.TiO_2/石墨烯复合材料的合成及光催化分解水产氢活性[J].无机化学学报,2009,11:1903-1907.
[2]刘畅.英国高等法院改革述评及对我国司法改革的启示[D].西北民族大学,宪法与行政法,2012,硕士.
[3]周敏敏.基于CFD的石脑油裂解炉管流场结构化研究[D].华东理工大学,化学工程,2014,硕士.
[4]朱龙飞.混成建模语言HyML及其语义理论研究[D].华东师范大学,计算机应用技术,2014,博士.
[5]储卫兵.泰州市海陵区新材料产业选择与发展布局的研究[D].南京农业大学,公共管理,2011,硕士.
[6]冯磊.甘肃省公共卫生支出实证分析[D].兰州商学院,财政学,2013,硕士.
[7]詹美蓉.电子受体对超高浓度乙醇发酵副产物形成的影响[D].华侨大学,微生物,2013,硕士.
[8]谷宏宇.硫酸镁早期干预急性胆源性胰腺炎疗效分析[D].大连医科大学,外科学,2012,硕士.
[9]宋荣峰.恶性浆膜腔积液的ras基因突变和P21～（ras）蛋白表达状况及其诊断价值[D].江西医学院,内科学消化,2003,硕士.
[10]郑家宜.城市应急文化建设研究[D].广西师范大学,行政管理,2013,硕士.
[11]汪海瑛,白晓民.并网光伏的短期运行备用评估[J].电力系统自动化,2013,05:55-60.
[12]丛蓉,王秀坤,吴军,周岩.基于Web-LogMining寻找目标网页最优期望定位[J].计算机工程与应用,2004,34:151-153+178.
[13]何乃珠.猪圆环病毒2型ORF2基因的克隆与序列分析及其真核表达[D].扬州大学,预防兽医学,2012,硕士.
[14]焦学文.阳泉矿区西北部山西组沉积环境研究[D].中国矿业大学,矿产普查与勘探,2014,硕士.
[15]赖燕山.WANLI轮胎企业发展战略研究[D].广东工业大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[16]田为刚.基于有限模糊规则的非线性系统模糊自适应控制[D].广东工业大学,控制理论与控制工程,2014,硕士.
[17]刘奕辉.全面风险管理在我国发电企业管理中的应用研究[D].北京交通大学,2010.
[18]单瑛遐.高三学生心理健康现状调查及其与社会支持、自我效能感的关系研究[D].湖南师范大学,基础心理学,2013,硕士.
[19]廖小琴,孙建军,郑彦宁,潘云涛.高校微博互链网络的核心-边缘结构分析——链接结构和信息分布视角[J].情报科学,2014,01:119-123+149.
[20]白雅杰.基于蓝黄互补色的白光有机电致发光器件研究[D].兰州大学,微电子与固体电子学,2014,硕士.
[21]郝亚峰.个人基因组数据可视化研究与实现[D].哈尔滨工业大学,计算机科学与技术,2013,硕士.
[22]李桂元.ZL沙坝区强噪声、低信噪比地震资料的处理方法[J].石油地球物理勘探,1993,02:199-206+248.
[23]刘海娜.基于HTML5的全景漫游技术研究[D].郑州大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[24]黄华.对外汉语教学中形近字的教学方法研究[D].内蒙古师范大学,汉语国际教育（专业学位）,2013,硕士.
[25]王兆星.水解-AICS工艺处理东北小城镇污水脱氮除磷效能的研究[D].哈尔滨工业大学,环境科学与工程,2013,硕士.
[26]郭红霞.混合效应模型的广义P值检验[D].北方工业大学,应用数学,2014,硕士.
[27]于洪琦.2011年男排世界杯中、日、伊亚洲三强对比分析[D].北京体育大学,体育教育训练学,2013,硕士.
[28]王玮,蔡莲红.关联规则的高效挖掘算法研究[J].小型微型计算机系统,2002,06:708-710.
[29]刘佳苗.引种江南桤木对崇西湿地芦苇群落土壤中产甲烷菌及甲烷氧化菌群落的影响[D].上海大学,环境工程,2013,硕士.
[30]李霞.我国民间借贷的商法规制[D].沈阳工业大学,民商法学,2012,硕士.
[31]王婷.金融工具减值模型改革对我国的影响及对策[D].山东财经大学,会计学,2012,硕士.
[32]余潇.海峡两岸食品添加剂标准与管理对比研究[D].福建农林大学,食品加工与安全,2012,硕士.
[33]赵剑.用于激光目标识别测量的光学系统设计[D].西安电子科技大学,电子与通信工程,2012,硕士.
[34]张旦旦.吴英非法集资案研究分析[D].兰州大学,刑法学（专业学位）,2013,硕士.
[35]张连旭.等离子喷焊钴基WC复合耐磨涂层组织与性能探究[D].哈尔滨工业大学,材料工程,2014,硕士.
[36]李金义.沈阳市城区空气质量预报两种模式的对比研究[D].南京气象学院,气象学,2003,硕士.
[37]郭英平.智能化家居控制系统的设计[D].吉林大学,电子与通信工程,2012,硕士.
[38]王文栋.产品设计应作好价值分析[J].纺织经济研究.1994(08)
[39]谢姣娣.张楚廷教育美学思想初探[D].湖南师范大学,高等教育学,2014,硕士.
[40]王鹏,邰能灵,王波,翟海青,叶剑,李磊,朱家栋,漆梁波.针对气象因素的短期负荷预测修正方法[J].电力系统自动化,2008,13:92-96.
[41]张木喜.中职示范校实施“6S”管理的策略及相关问题研究[D].广东技术师范学院,职教,2014,硕士.
[42]葛秀花.台家庄潜山的发现及解释[J].石油地球物理勘探,1987,04:489.
[43]李泽文,姚建刚,曾祥君,邓丰,楚湘辉.基于数字锁相原理的GPS高精度同步时钟产生新方法[J].电力系统自动化,2009,18:82-86.
[44]崔丹.朝鲜族村落老年群体文化的重构[D].辽宁大学,民俗学,2012,硕士.
[45]曾翔.冲击和快速加载作用下钢筋混凝土梁柱构件性能试验与数值模拟研究[D].湖南大学,结构工程,2014,博士.
[46]陈一虎.基于网络的化学自主学习研究[D].华东师范大学,课程与教学论,2003,硕士.
[47]杨璐.基于频率衰减的储层流体识别方法[D].成都理工大学,固体地球物理学,2013,硕士.
[48]张锰.PrMnO_3前驱体对ZnO-Pr_6O_(11)基压敏陶的影响[D].内蒙古科技大学,材料学,2013,硕士.
[49]张蔚.《埃涅阿斯纪》中的宗教民俗事象研究[D].淮北师范大学,文艺学,2014,硕士.
[50]高露.食品上市公司文化、社会责任与财务绩效的关系研究[D].重庆工商大学,会计学,2014,硕士.