布鲁氏菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立和临床应用的初步研究

【摘要】目的：建立基于Taqman探针实时荧光定量PCR快速检测布鲁氏菌的方法，并对其在临床上的应用进行初步的探索；并为将实时荧光定量PCR方法应用于布鲁菌病患者治疗后的追踪随访提供实验室依据。方法：选用布鲁氏菌高度保守的16SrDNA序列设计引物，并选用属特异性位点设计了FAM、BHQ1标记的TaqMan荧光探针，根据实时荧光定量PCR的原理和技术，建立了布鲁氏菌实时荧光定量PCR检测方法，并构建了布鲁氏菌荧光定量PCR绝对定量的标准品，通过对该反应体系进行优化，制作标准曲线。应用上述建立的基于TaqMan布鲁氏菌实时荧光定量PCR方法对吉林大学第一医院感染科2012年7月~2013年8月间明确诊断为布鲁氏菌病的50例住院患者的100份外周血样本和同期随机选择的30位健康志愿者的60份外周血样本（对照组）进行检测，并与标准试管凝集试验和细菌血培养法做对比分析；对8例经实时荧光定量PCR检测为阳性的布鲁氏菌病患者进行跟踪随访，在其确诊时，治疗1个月和治疗疗程结束三个时间点分别采集患者外周血标本行布鲁氏菌实时荧光定量PCR检测，继而监测其布鲁氏菌DNA载量的变化。结果：本实验成功的以16SrDNA设计了布鲁氏菌引物及TaqMan探针，并构建了布鲁氏菌的阳性标准品，制作标准曲线，其相关系数为R2=0.996。布鲁氏菌实时荧光定量PCR检测反应的灵敏度为102copies/μL，对参考菌株及阴性对照物均为特异性扩增，且组内及组间重复性好。对50例经血培养和/或凝集试验确诊为布鲁氏菌病患者进行检测，发现所建立的布鲁氏菌实时荧光定量PCR检测结果为阳性的患者48例（96%），布鲁氏菌实时荧光定量PCR的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为96%，100%，100%，93.8%。实时荧光定量PCR和试管凝集试验组合检测的阳性一致率高达92%，一致性检测的可信度较高，其Kappa系数为0.468（P=0.00，有统计学意义）。对8例实时荧光定量阳性患者进行随访，发现布鲁氏菌DNA载量在治疗1个月后明显下降，治疗疗程结束后仍有3例患者仍可检测到布鲁氏菌DNA载量，尽管临床症状消失。结论：本研究所建立的基于TaqMan探针布鲁氏菌实时荧光定量PCR方法具有敏感度高、特异性好等特点，而且快速、准确，在对临床标本检测中，其敏感性、特异性、阳性预测值（PPV）、阴性预测值（NPV）均高于试管凝集试验和血培养方法，可以用于临床上布鲁氏菌病的诊断和流行病学的监测，此外，由于RT-PCR/SAT组合的阳性一致率及可信度较高，因此，该方法适用于检测布鲁氏菌病早期中经血培养或凝集试验阴性的患者，以及凝集试验的确证试验。本次所建立的实时荧光定量PCR方法可以用于布鲁氏菌病患者治疗后的跟踪随访，同时可通过监测患者体内布鲁氏菌DNA载量的变化，为布鲁氏菌病临床分期、抗布病药物的疗效观察、布鲁氏菌病复发的监测等提供实验室方面的依据。
【作者】曾庆贺；
【导师】王峰；
【作者基本信息】吉林大学，临床医学，2014，硕士
【关键词】布鲁氏菌；实时荧光定量PCR；TaqMan探针；临床诊断；

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