急性白血病患者MN1、P16及RARβ基因表达变化及临床意义

【摘要】目的：①探讨急性髓系白血病(AML)患者中脑膜瘤1（MN1）基因和microRNA-181b(miR-181b)、microRNA-20a(miR-20a)的表达特点、预后意义及MN1与临床特征、分子学特征的关系。②探讨启动子区域DNA甲基化对AML患者及急性白血病细胞株中抑癌基因p16INK4a(p16)、retinoicacidreceptorβ(RARβ)表达的影响。③探讨地西他滨（DAC）与全反式维甲酸（ATRA）作用急性白血病细胞株后p16、RARβ基因表达变化及细胞的增殖、分化、凋亡，揭示DAC与ATRA治疗急性白血病的作用机制。方法：①采用实时定量reversetranscriptasepolymerasechainreaction（RT-PCR）技术检测158例初诊AML患者及20例健康供者骨髓单个核细胞中MN1基因及miR-181b、miR-20a的表达水平。②采用实时定量RT-PCR及甲基化特异性PCR（Methylation-specificPCR，MSP）技术检测30例初诊AML患者及20例健康供者骨髓单个核细胞、U937、SHI-1及K562急性白血病细胞株中p16、RARβ基因mRNA表达水平及其启动子区域DNA甲基化状态。③采用RT-PCR、Western印迹法及MSP技术检测DAC与ATRA处理细胞株48h后p16、RARβ基因表达在mRNA和蛋白水平的改变及其启动子区域DNA甲基化状态的改变。④采用WST-1法、流式细胞术及AnnexinV/PI双染流式细胞术检测DAC与ATRA处理细胞株24h、48h、72h后细胞的生长抑制率、细胞分化指标CD14、CD11b及细胞的早期凋亡率。结果：①AML中MN1基因和miR-181b、miR-20a表达水平均较正常对照组显著升高(Z=-4.089，P<0.001；Z=-2.386，P=0.017；Z=-2.186，P=0.029)；各FAB亚型中M1、M5和M6型miR-181b表达水平及M4、M5型miR-20a表达水平较正常对照组显著升高(P<0.05)。多变量分析中，MN1及miR-181b高表达与较低的完全缓解率(P=0.01；P=0.03)、较短的无复发生存(P=0.02；P=0.045)和总生存有关(P=0.02；P=0.017)，而miR-20a高表达与较高的完全缓解率(P=0.008)、较长的总生存有关(P=0.04)。AML患者MN1高表达与与脾脏肿大呈正相关(χ2=4.341，P=0.037)，与NPM1野生型呈正相关（χ2=10.452，P=0.001），与miR-181b的表达水平呈正相关（rs=0.319，P=0.035），与miR-20a的表达水平呈负相关（rs=-0.202，P=0.015）。②RT-PCR检测p16、RARβ基因mRNA表达发现AML患者及U937、SHI-1、K562细胞株中p16、RARβ表达水平极低，而健康供者其表达水平则高；同时在MSP中发现p16、RARβ表达水平极低的AML患者及U937、SHI-1细胞株中存在p16、RARβ启动子区域DNA高甲基化，而在健康供者中无该部位的DNA甲基化，K562细胞株只存在p16启动子区域DNA高甲基化，不存在RARβ启动子区域DNA甲基化。③经不同终浓度的DAC[1μmol/l(1DAC)、2μmol/l(2DAC)、4μmol/l(4DAC）]和ATRA[0.5μmol/l(0.5RA)]单用或联用处理U937、SHI-1及K562细胞株48h后，U937细胞中两药单用或联用组p16、RARβ基因在mRNA和蛋白水平的表达均较对照组升高（P<0.05），SHI-1及K562细胞中两药联用组RARβ基因在mRNA和蛋白水平的表达均较对照组升高（P<0.05），而两药单用或联用组均对p16基因的表达无上调作用，并且DAC单用或联合ATRA组伴随着其启动子区域DNA甲基化水平的下降和未甲基化水平的升高，而ATRA单用组未改变其启动子区域DNA高甲基化状态；DAC的作用呈浓度依耐性，以4DAC+0.5ATRA组作用最明显（P<0.05）。④经不同终浓度的DAC(1DAC、2DAC、4DAC）]和ATRA(0.5RA)单用或联用处理U937、SHI-1及K562细胞株24h、48h、72h后，两药单用或联用组能有效诱导U937细胞的生长抑制、分化及凋亡（P<0.05），并且DAC的作用呈浓度依耐性，以4DAC+0.5ATRA组作用最明显（P<0.05）；DAC单用或联合ATRA组能有效抑制SHI-1细胞增殖，而单用ATRA组无生长抑制作用，两药单用或联用组能有效诱导SHI-1细胞的分化与凋亡（P<0.05），并且DAC的作用呈浓度及时间依耐性，以4DAC+0.5ATRA组作用最明显（P<0.05）；DAC与ATRA对U937、SHI-1细胞生长抑制、诱导分化及促凋亡具有协同作用；两药单用或联用对K562细胞无生长抑制、诱导分化和促凋亡作用（P>0.05）。结论：①MN1和miR-181b、miR-20a在AML患者中高表达，MN1基因及其相关miRNAs的高表达与AML患者预后密切相关，可作为AML发病及预后判断的有意义指标。②DAC联合ATRA能上调抑癌基因p16、RARβ的表达水平，并能诱导U937、SHI-1细胞的生长抑制、分化及凋亡，具有临床治疗AML的潜力。
【作者】向立丽；
【导师】顾伟英；
【作者基本信息】苏州大学，内科学，2014，硕士
【关键词】急性白血病；MN1基因；地西他滨；全反式维甲酸；P16基因；RARβ基因；MSP；

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