细胞骨架蛋白MICAL-L2和ACTN4在上皮性卵巢癌中的表达及其功能研究

【摘要】目的：通过对上皮性卵巢癌组织和细胞的体内外实验研究，探讨细胞骨架蛋白MICAL-L2及其相互作用蛋白α-辅肌蛋白4（ACTN4）在卵巢癌发生发展和侵袭转移中的作用及可能机制。方法：（1）用免疫组化法检测人上皮性卵巢癌组织芯片中MICAL-L2蛋白的表达，探讨MICAL-L2与人卵巢癌临床病理特征之间的关系。（2）利用慢病毒转染技术构建稳定干扰MICAL-L2的人卵巢癌细胞株，采用CCK8方法、划痕实验、空穿实验、胶穿实验等方法检测干扰MICAL-L2后对细胞增殖，迁移及侵袭功能的影响。（3）利用细胞免疫荧光技术检测干扰MICAL-L2后细胞形态变化及EMT相关分子标志物的变化。（4）利用westernblotting方法检测EMT相关分子标志物及下游通路中相关分子在干扰MICAL-L2组和对照组中的变化情况。（5）利用RT-PCR方法检测EMT过程中相关转录因子的变化。（6）利用荧光素酶报告基因检测Wnt通路中TOP/FOP的活性变化情况。（7）利用RT-PCR方法及siRNA干扰方法初步验证MICAL-L2与ACTN4的相互作用关系。（8）利用TCGA数据库分析ACTN4与卵巢癌预后之间的关系。（9）利用MTT和流式细胞术的方法分析ACTN4与卵巢癌耐药的关系及可能机制。结果：（1）MICAL-L2在上皮性卵巢癌中的高表达率（68.60%）明显高于正常对照组（16.67%），差异有显著性（P<0.0001）。MICAL-L2在卵巢癌III-IV期中的高表达率（81.40%）显著高于I-II期（55.81%）（P=0.011）；在组织学分级为G2、G3中的高表达率显著高于G1期（P=0.009）。（2）稳定干扰MICAL-L2基因后，与对照组比较，细胞增殖、迁移及侵袭能力均明显减弱，差异有显著性（p值均＜0.01）。(3)细胞免疫荧光检测F-actin、上皮分子标志物E-cadherin、间质分子标志物vimentin发现，干扰稳定MICAL-L2后细胞形态发生重要变化，由梭形变为圆形，细胞与细胞间连接更加紧密，上皮分子标志物E-cadherin明显增多，间质分子标志物vimentin表达明显下降。（4）westernblotting结果显示：上皮分子标志物E-cadherin表达升高，间质分子标志物vimentin表达明显下降，胞核中β-catenin表达明显降低，胞浆中无变化，p-β-catenin无变化，Wnt/β-catenin通路下游Cyclin-D1表达降低。(5)RT-PCR方法检测EMT转录因子SNAIL、SLUG、TWIST、ZEB1和ZEB2在干扰MICAL-L2组和对照组变化，结果显示干扰MICAL-L2后SNAIL和SLUG无变化，TWIST、ZEB1和ZEB2在mRNA水平表达明显降低且有统计学意义（P<0.05）。（6）TOP/FOP荧光素酶报告基因检测Wnt通路中转录活性的变化，结果显示干扰MICAL-L2后TOP活性较对照组明显降低，FOP活性无明显变化。（7）RT-PCR方法及siRNA干扰方法分析MICAL-L2与ACTN4的关系，结果发现在高表达MICAL-L2的细胞株中ACTN4表达也相应较高，瞬时干扰MICAL-L2后ACTN4表达也明显降低（8）TCGA数据库分析ACTN4与卵巢癌患者预后明显相关，ACTN4基因改变的患者预后较差，且有统计学意义（P<0.01）。(9)转染ACTN4-siRNA的卵巢癌细胞对化疗药紫杉醇敏感性增加（P＜0.05)，凋亡率增加（P＜0.05)。结论：1、卵巢癌组织中MICAL-L2高表达与卵巢癌临床分期和组织学分级有关。2、MCIAL-L2可促进卵巢癌细胞的增殖，迁移和侵袭。3、MICAL-L2能促进卵巢癌细胞EMT的发生。4、激活经典的Wnt/β-catenin通路以及促进Rac1的活化可能是MICAL-L2引起卵巢癌细胞EMT的发生的机制之一5、ACTN4与卵巢癌不良预后关系密切，其可能通过抑制卵巢癌细胞的凋亡参与对紫杉醇的化疗抵抗。6、抑制MCIAL-L2和ACTN4将为卵巢癌的临床治疗提供一个新的靶点。
【作者】朱琳艳；
【导师】张蓉；
【作者基本信息】苏州大学，妇产科学，2014，硕士
【关键词】MICAL-L2；ACTN4；上皮性卵巢癌；EMT；Wnt/β-catenin通路；增殖；侵袭；凋亡；

【参考文献】
[1]张锐.多金属氧酸盐微纳米晶体的合成组装及性质研究[D].北京化工大学,2013.
[2]刘惠瑶.现代汉语称呼语探究[D].河北师范大学,汉语言文字学,2004,硕士.
[3]狄春雨.一种基于搜索树的RFID防碰撞算法研究[D].吉林大学,通信与信息工程,2014,硕士.
[4]张生昌,杨琳,邓鸿英,马艺,王炤东.球阀与阀组结构参数变化规律的分析研究[J].液压气动与密封,2014,07:6-9.
[5]宁德义,唐本东,刘云生,王飞川.中国煤层气含量测定技术[J].中国煤层气.1996(01)
[6]徐佳佳.我国铁矿石进口价与汇率的关系研究[D].南京财经大学,金融学,2012,硕士.
[7]肖江文.美国文化产业的发展分析及对我国的启示[D].首都经济贸易大学,产业经济学,2013,硕士.
[8]刘朝.北朝至两宋时期河南古塔研究[D].郑州大学,考古学及博物馆学,2013,硕士.
[9]李维修.几种典型结构的空间碎片在轨感知声发射源定位技术研究[D].哈尔滨工业大学,人机与环境工程,2013,硕士.
[10]李秋叶.辽西二道沟—金厂沟梁金矿田控矿构造特征与找矿预测[D].中国地质大学（北京）,构造地质学,2013,硕士.
[11]李庆康.《植物生态学报》“ICT”最佳论文奖及其赞助单位介绍[J].植物生态学报,2001,03:370.
[12]杨斌.中文文本数据挖掘研究[D].湘潭大学,2002.
[13]李建奇.耐高温烧结钕铁硼磁体的制备及性能研究[D].华南理工大学,材料工程,2012,硕士.
[14]张烨.非英语专业本科生各阶段英语词汇学习策略研究[D].中国海洋大学,外国语言学与应用语言学,2003,硕士.
[15]本报记者梁裕.中钢吉炭三季报折戟[N].华夏时报,2012-10-29A03.
[16]高静.Ti-23Al-26Nb合金多层结构SPF/DB工艺[D].哈尔滨工业大学,材料加工工程,2014,硕士.
[17]杨俊哲.高速异步电机参数化设计[D].哈尔滨工业大学,机械工程,2013,硕士.
[18]陈振宁,吕维松,杨自厚,张宏勋,钟延炯.第五届IFAC采矿、冶金、金属加工自动化会议综述(上)[J].冶金自动化,1987,03:2-6.
[19]詹振环.基于双多核DSP的图像处理平台设计[D].中国科学院研究生院（西安光学精密机械研究所）,电子与通信工程,2013,硕士.
[20]李黎.论改革和完善我国中小企业财政扶持体系[D].天津财经大学,财政学,2012,硕士.
[21]关旭鹏.分布式舰载雷达目标跟踪和数据融合仿真[D].哈尔滨工业大学,信息与通信工程,2014,硕士.
[22]魏乐,张秋生,赵立彬.我国产业重组与转移:基于跨区域并购复杂网络的分析[J].经济地理,2012,02:89-93.
[23]俞祺锟.基于CORBA的网管告警接口设计及实现[D].华东理工大学,软件工程,2013,硕士.
[24]王峭.敏化剂改性纳米TiO_2的光催化性能研究[D].兰州理工大学,材料学,2014,硕士.
[25]靳怡.操纵证券市场行为之民事责任研究[D].外交学院,国际法,2004,硕士.
[26]黄琼.透辉石—钠长石—钙长石体系（Di-Ab-An）快速冷却结晶的枝晶研究[D].中国地质大学,矿物学、岩石学、矿床学,2003,硕士.
[27]李文淑.增能理论视角下的残疾人就业问题研究[D].山东大学,社会工作（专业学位）,2013,硕士.
[28]邵家营.开发区的空间拓展与治理研究[D].华东师范大学,人文地理学,2013,硕士.
[29]褚敏.缺血修饰性白蛋白（IMA）在慢性肝病及慢性肾脏病间的差异及其临床意义探讨[D].吉林大学,临床医学,2014,硕士.
[30]顾婷婷,许敏,赵以军,程凯.温度与CO2浓度升高对集胞藻PCC6803修复UV损伤的关键基因转录量的影响[J].生态学报,2015,09:.
[31]董贻正.真经如何取到手——学邯钢管理经验之我见[J].经济论坛.1995(23)
[32]程霖,欧阳杰,赵志明.喷混凝土水化热对隧道温度场的影响[J].山西建筑,2015,07:165.
[33]张显晨.氟在茶树体内的富集规律研究与测定方法优化[D].安徽农业大学,营养与食品卫生,2011,硕士.
[34]彭涛.水体中铅的浓度对南方鲇的生理生态学影响[D].西南大学,水生生物学,2013,硕士.
[35]李汉平.词块教学应用于高职商务英语口语课堂的实证研究[D].河北科技大学,英语语言文学,2014,硕士.
[36]侯涛.基于ZigBee技术的智能家居的网关设计[D].哈尔滨理工大学,电子与通信工程,2012,硕士.
[37]李卓.许鞍华导演电影研究[D].西南大学,电影学,2014,硕士.
[38]徐昌曦.活性炭纤维光催化改性研究[D].东华大学,材料学,2004,硕士.
[39]夏元清,黄一,许可康,韩京清.大射电望远镜FAST馈源舱位姿控制[J].控制与决策,2004,02:195-198+203.
[40]陈燕.基于ODT的DWG文件标题栏信息自动提取的实现[D].华东师范大学,计算机应用技术,2004,硕士.
[41]易兆红.六自由度并联平台运动仿真与精度预测系统开发[D].哈尔滨工业大学,机械制造及其自动化,2014,硕士.
[42]董莹.吉林省中小企业成长相关要素实证研究[D].吉林大学,企业管理,2013,硕士.
[43]李斌.川芎油软胶囊治疗偏头痛急性发作期（血瘀证）即刻止痛作用的临床研究[D].成都中医药大学,中医内科学,2012,硕士.
[44]周田莉.奇志大兵相声的认知语境研究[D].武汉理工大学,外国语言学及应用语言学,2012,硕士.
[45]陈亮.基于本地劳动力就业的产业选择研究[D].南京农业大学,产业经济学,2012,硕士.
[46]岳治萍.戴相龙全球PE北京论坛主题演讲模拟交替传译实践报告[D].河北师范大学,翻译,2013,硕士.
[47]朱卫国.三跨连续梁拱组合体系桥梁的分析及其试验研究[D].浙江大学,2003.
[48]黄方.基于IEC61499功能块的应用研究[D].浙江大学,控制理论与控制工程,2004,硕士.
[49]李国祥.机翼整体壁板喷丸成形技术的发展[J].航空工艺技术.1990(03)
[50]李小姗,刘卫国,郭欢,刘春玲.GP/NiOOH/Ni(OH)_2的制备及电化学性能[J].电池,2015,01:37-40.