单基因遗传性骨病的临床与分子病因学研究

【摘要】第一部分X连锁显性低磷性佝偻病PHEX基因突变筛查目的：低磷性佝偻病（Hypophosphatemicrickets,HR）是一组因肾脏丢失磷酸盐导致血磷降低，引起骨矿化异常的疾病。临床上有四种类型，其中以X连锁显性低磷性佝偻病（X-linkeddominanthypophosphatemicrickets,XLH）最为常见。该病主要临床特征包括：身材矮小，骨骼疼痛，牙齿发育不良，下肢发育畸形，儿童佝偻病等。实验室特征性指标主要包括：血磷降低，血钙正常，碱性磷酸酶明显升高。大部分XLH病例是由PHEX基因突变导致，该基因是X染色体上与肽链内切酶同源的磷酸盐调控基因（phosphate-regulatinggenewithhomologytoendopeptidasesontheXchromosome）。我们的研究目的在于鉴定4个中国XLH家系PHEX基因的突变位点，探讨XLH发病的分子遗传学机制。方法：以临床确诊的4个家系中7例具有典型症状的XLH患者为研究对象，提取4个家系中的7例患者、其他健康家族成员及250例正常志愿者（男性125例，女性125例）的外周血进行基因组DNA检测，应用聚合酶链反应（PCR）扩增PHEX基因全部外显子，其产物进行直接测序。同时对研究对象进行实验室检查及影像学检测。结果：我们对7例患者进行PHEX基因测序后发现，第一个家系中，先证者及其患病的姐姐都携带一个位于外显子15的杂合错义突变（c.1601C>T），导致534位的脯氨酸突变为亮氨酸（P534L）。在第二个家系中，先证者及其母亲携带一个位于外显子20的杂合插入突变（c.2033dupT），导致自突变位点的碱基均向3’端移动了一位，使得679位苏氨酸突变为组氨酸，679位之后的第38位成终止密码子，提前终止了翻译过程（T679Hfs38X）。在第三个家系中，先证者携带一个位于外显子11的无义突变（c.1294A>T），导致432位赖氨酸突变为终止密码子（K432X）。在第四个家系中，先证者及其患病的父亲都携带一个位于外显子22的杂合错义突变（c.2192T>C），导致731位苯丙氨酸突变为丝氨酸（F731S）。通过检索突变数据库发现，p.T679H、p.K432X、p.F731S均为新突变。另外，我们分析了13种不同物种的PHEX基因序列后发现，在534位点和731位点，这13种物种的序列完全一致，为保守序列。P534L、T679H、K432X和F731S均未在健康家庭成员及250个正常对照中检测到。结论：本研究发现的PHEX基因p.T679H、p.K432X、p.F731S突变是新突变，是引起XLH的主要原因。我们的发现有助于了解中国XLH患者的基因遗传基础，丰富XLH的基因型-表型谱，PHEX基因突变分析对XLH的早期分子诊断和治疗具有重要的临床意义。第二部分多发性骨软骨瘤EXT1和EXT2基因突变筛查目的：多发性骨软骨瘤（Multipleosteochondromas,MO）是一种以多发性外生骨疣为特征的常染色体显性遗传性骨病，发病率大约为1-2/100000。外生骨疣通常在出生后开始形成，随着骨的生长，其大小及数量逐渐增加，直至骨骺闭合。在这类患者中，外生骨疣常生长于多个关节或同一个关节的多个部位。绝大部分多发性骨软骨瘤的患者是由于Exostosin-1（EXT1）和Exostosin-2（EXT2）基因突变所致。在本研究中，我们的研究目的在于鉴定10个中国MO家系EXT1和EXT2基因的突变位点，探讨MO发病的分子遗传学机制。方法：以临床确诊的，具有典型MO临床表现的10个中国家系的46例患者为研究对象，提取全部家系中的12位患者、其他健康家族成员及250例正常志愿者的外周血进行基因组DNA检测，应用聚合酶链反应（PCR）扩增EXT1和EXT2基因全部外显子，产物进行直接测序，同时对研究对象行影像学检测。结果：我们对12例患者进行EXT1和EXT2基因测序，发现共有9个不同位点的突变，其中EXT1基因中有5个，EXT2基因中有4个。家系1，先证者携带有EXT1基因外显子1的无义突变：p.Gln27X（c.79C>T）。家系2，先证者同时携带EXT1基因外显子1的移码突变：p.Asn173LysfsX16（c.518dupA）和EXT2基因外显子9的两个错义突变：p.Gln452Lys（c.1354C>A）和p.Ile473Asn（c.1418T>A）；先证者母亲携带EXT2基因外显子9的错义突变：p.Ile473Asn（c.1418T>A）。家系4，先证者携带EXT1基因外显子1的移码突变：p.Leu272ArgfsX4（c.815delT）。家系5，先证者携带EXT2基因外显子2的无义突变：p.Gln44X（c.130C>T）。家系7，先证者携带EXT2基因外显子8的无义突变：p.Trp396X（c.1187G>A）。家系8，先证者携带EXT1基因外显子9的无义突变：p.Tyr592X（c.1776C>A）。家系10，先证者及其母亲共同携带EXT1基因外显子2的错义突变：p.Arg340His（c.1019G>A）。而在家系3、6及9中未发现有突变基因。上述突变基因均未在健康家庭成员及250个正常对照者中检测到。结论：我们发现EXT1基因突变中：p.Gln27X，p.Asn173LysfsX16，p.Leu272ArgfsX4和EXT2基因突变中：p.Ile473Asn，p.Gln452Lys，p.Gln44X是新突变。家系2中EXT1基因突变：p.Asn173LysfsX16和EXT2基因突变：p.Gln452Lys，家系8中EXT1基因突变：p.Tyr592X是新生突变。我们的发现有助于扩展EXT1和EXT2的基因突变谱，便于深入了解中国多发性骨软骨瘤患者的基因遗传基础。第三部分软骨发育不全FGFR3基因突变筛查目的：软骨发育不全（Achondroplasia，ACH）是人类短肢型侏儒症中最常见的类型，发病率约为1/15000-1/77000，是一种常染色体显性遗传性疾病，大多数病例为散发。受累个体常因四肢肢根型短小而导致躯体矮小。脸部特征主要包括额面部隆起，面中部发育不全。另外有明显的腰椎前凸，肘关节伸直障碍，双膝内翻，三叉手畸形等。该病主要是由位于人类4号染色体p16.3的纤维母细胞生长因子-3（Fibroblastgrowthfactorreceptor-3FGFR3）基因突变导致，该染色体包括19个外显子，编码806个碱基。本研究目的在于分析5个中国家系中患有软骨发育不全的患者，鉴定是否存在FGFR3基因的常见突变位点，探讨该病的分子遗传学机制。方法：以确诊的具有典型临床症状的5个无亲缘关系的软骨发育不全家系为研究对象。提取患者、其他健康家族成员及250例正常健康志愿者外周血进行基因组DNA检测，应用聚合酶链反应（PCR）扩增FGFR3基因全部外显子区域，对PCR产物进行直接测序。同时对研究对象行影像学检测。结果：我们对患者进行FGFR3基因测序后发现其均携带一个位于外显子9的杂合错义突变（c.1138G>A），导致380位甘氨酸突变为精氨酸（G380R）。家庭中其他健康成员，以及250名健康志愿者均未发现FGFR3基因突变。该错义突变在四个家系中为新突变。结论：本研究发现FGFR3基因G380R突变是引起患者软骨发育不全临床症状的病因，并证实该基因G380R突变是引起软骨发育不全最常见的突变。我们的发现有助于了解中国软骨发育不全患者的基因遗传基础。FGFR3基因突变分析对软骨发育不全的早期诊断和产前基因诊断具有重要的临床意义。
【作者】徐佳；
【导师】康庆林；
【作者基本信息】苏州大学，外科学，2014，硕士
【关键词】X连锁显性低磷性佝偻病（XLH）；PHEX；基因突变；多发性骨软骨瘤（MO）；Exostosin-1（EXT1）；Exostosin-2（EXT2）；软骨发育不全（ACH）；Fibroblastgrowthfactorreceptor-3（FGFR3）；G380R；

【参考文献】
[1]姜钟平,刘腾飞.量化非线性控制——综述(英文)[J].自动化学报,2013,11:1820-1830.
[2]逯志宏,刘广友,马文静.大功率交交变频全数字矢量控制系统在济钢中厚板精轧机上的应用[J].冶金自动化,2004,02:48-49.
[3]李安.通络消肿膏治疗旋后外旋型Ⅰ°、Ⅱ°踝关节损伤的临床疗效观察[D].广州中医药大学,中医骨伤科学（专业学位）,2013,硕士.
[4]吴建.淀粉基全生物降解材料的研究[D].江苏科技大学,材料学,2013,硕士.
[5]李国哲.探针式光纤液位传感器的仪器化研究[D].大连理工大学,光学工程,2004,硕士.
[6]史岩,傅泽田,祁力钧,李芝银.垂直小目标雾滴分布试验[J].农业机械学报.2004(04)
[7]李仙仙.马钱子碱对人白血病细胞株HL-60细胞的作用研究[D].山西医科大学,血液内科,2013,硕士.
[8]陈真勇,何永勇,褚福磊,黄靖远.基于遗传进化的最近邻聚类算法及其应用[J].控制与决策,2002,04:469-472.
[9]丁恒兵.势函数聚类方法在高校学生评估模型系统中的应用[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[10]唐朝辉.“准补词”初探[D].扬州大学,汉语言文字学,2011,硕士.
[11]孙蓉琳,曹烈.马钢第三炼钢厂转炉煤气回收装置的过程控制[J].冶金自动化,2002,05:54-56.
[12]许嘉.包装设计中色彩的应用[D].内蒙古师范大学,美术学,2012,硕士.
[13]方显凯.浙江物产（迁安）国际供应链物流基地盈利模式创新研究[D].燕山大学,工商管理,2012,硕士.
[14]孙兆磊.“留白”手法在中日近现代音乐作品中的应用研究[D].内蒙古师范大学,音乐学,2013,硕士.
[15]潘燕飞.正常糖耐量孕妇不同血糖水平与妊娠结局的关系[D].南方医科大学,内科学,2012,硕士.
[16]程珂.基于J2EE架构统一用户管理系统的设计与实现[D].山东大学,计算机技术（专业学位）,2012,硕士.
[17]陶兰.两套泰国初中国别化初级汉语教材的对比研究[D].湖南师范大学,对外汉语,2014,硕士.
[18]方彰炎.混凝土轨枕裂损原因及其防治[J].铁道运营技术.1995(01)
[19]李怡林.《心理治疗简介》（第二章、第三章）翻译报告[D].四川外国语大学,翻译（专业学位）,2014,硕士.
[20]苏怀智,吴中如,戴会超.初探大坝安全智能融合监控体系[J].水力发电学报,2005,01:122-126+52.
[21]段传人,刘爱喜,王贵学,高旭,郭劲松,聂磊,暴佳芳.应用肠道微生物示踪地表水粪便污染的研究进展[J].微生物学通报,2013,12:2319-2329.
[22]侯嘉乐.不确定性规避对中国化妆品消费者消费行为的影响[D].西安外国语大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[23]张婩.基于THE DRESS CODE高级定制方案的研究[D].北京服装学院,设计艺术学,2012,硕士.
[24]李冉.协调生态环境压力的区域生态用地需求模拟[D].南京农业大学,地图学与地理信息系统,2012,硕士.
[25]柳红东,黄佳木,李新禄,刘佳,张育新.锂离子电池SnO_2/石墨烯复合负极材料的制备及其电化学性能[A].中国仪器仪表学会仪表功能材料学会、重庆市科学技术协会、重庆市科学技术研究院、重庆大学、重庆材料研究院（重庆仪表材料研究所）、中国人民解放军后勤工程学院、重庆功能材料期刊社、国家仪表功能材料工程技术研究中心.2011中国功能材料科技与产业高层论坛论文集（第二卷）[C].中国仪器仪表学会仪表功能材料学会、重庆市科学技术协会、重庆市科学技术研究院、重庆大学、重庆材料研究院（重庆仪表材料研究所）、中国人民解放军后勤工程学院、重庆功能材料期刊社、国家仪表功能材料工程技术研究中心:,2011:3.
[26]冀文峰.磁共振无线电力传输发射系统的研究与设计[D].河北大学,电路与系统,2014,硕士.
[27]刘卓群.非物质文化遗产视野下的冬布拉制作传承研究[D].新疆师范大学,音乐学,2013,硕士.
[28]郝勃.基于IPv6的车载CAN网络管理与通信技术研究[D].吉林大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[29]赵子健.高新技术产业开发区发展方向与规划布局研究[D].天津大学,城市规划与设计,2004,硕士.
[30]李海龙.居住环境景观设计中的吉祥寓意研究[D].苏州大学,设计艺术学,2013,硕士.
[31]刘洁.麦田圈解析及其艺术价值的研究[D].陕西科技大学,设计艺术学,2013,硕士.
[32]柴丽雅,刘松莹,杨颖,葛云龙,李丽,张国,史克英.氧化石墨烯与氧化锌复合材料的制备及室温NO_x气敏性能研究[J].人工晶体学报,2013,08:1611-1615.
[33]寿曼丽.基于ADL的安徽省高校图书馆联盟的建设与发展研究[D].安徽大学,图书馆学,2013,硕士.
[34]王亚兰.生物分子参与下ZnO层级结构的可控制备[D].河北师范大学,化学生物学,2013,硕士.
[35]张晓伟.视频中运动目标的检测与跟踪算法研究及应用[D].山东师范大学,计算机软件与理论,2013,硕士.
[36]周忠双.基于MPI的一类椭圆型方程有限差分区域分解算法的并行实现[D].山东大学,计算数学,2013,硕士.
[37]徐伟.聚乙烯醇/碘素偏光膜的制备及其性能研究[D].湖北大学,高分子化学与物理,2012,硕士.
[38]戴春锋.基于点表面的尖锐特征绘制及切割[D].上海交通大学,生物医学工程,2013,硕士.
[39]赵秀娟.基于FLAC3D的土、岩组合边坡稳定性分析[D].辽宁师范大学,自然地理学,2012,硕士.
[40]杨凡.沈阳市龙升培训学校营销策略研究[D].天津商业大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[41]刘晓平,张嗣瀛.动态奇异系统的主从策略[J].自动化学报,1992,06:737-741.
[42]申全.音乐院校体育教学与专业培养的协同教育可行性研究[D].天津体育学院,体育教学（专业学位）,2014,硕士.
[43]张超.论怀疑主义对民主的影响[D].华侨大学,马克思主义哲学,2004,硕士.
[44]叶征.平面几何的动态可视证明研究[D].浙江大学,2010.
[45]胡磊.秦源集团资金管理体系研究[D].西北大学,工商管理（专业学位）,2012,硕士.
[46]刘昌平,范明钰,王光卫,马素丽.基于梯度算法的支持向量机参数优化方法[J].控制与决策,2008,11:1291-1295+1300.
[47]时培成.汽车动力总成悬置系统隔振分析与优化研究[D].合肥工业大学,2010.
[48]王倩.TA29-Barnase转基因雄性不育芥菜的获得及豌豆花药特异启动子PsEND1功能分析载体构建[D].西南大学,植物学,2013,硕士.
[49]郭崇峙.水下隧道地基地震变形特征与结构地震响应分析[D].北京交通大学,岩土工程,2013,硕士.
[50]陈照军.中小企业融资创新研究[D].首都经济贸易大学,企业管理,2014,硕士.