非血缘脐血移植后CMV感染患者NK细胞表型和受体重建的特点研究

【摘要】目的巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)感染是脐血移植后常见的一种并发症,但目前一些对CMV感染患者的免疫重建发现,CMV感染可能对造血干细胞移植(Hematopoieticstemcelltransplantation)后的免疫重建起到一定的促进作用,因此CMV-DNA拷贝数在一定的范围内可以不进行治疗。但目前对非血缘脐血移植(Unrelatedcordbloodtransplantation,UCBT)后发生CMV感染者的免疫重建研究较少,尤其是国内在此方面的研究更少。我们此项研究为了观察恶性血液病(Hematologicmalignancies)患者进行UCBT后发生CMV感染者自然杀伤细胞(Naturalkillercell,NK)的表型和受体重建特点,为日后进行CMV的免疫治疗提供依据和理论基础。方法回顾性分析76例进行UCBT的恶性血液病患者,所有患者采用强化清髓性的预处理方案,预防移植物抗宿主病(Graft-versus-hostdisease,GVHD)的方案为环孢素(Cyclosporine)和吗替麦考酚酯(Mycophenolatemofetil,MMF)。因为研究需要,选择的病例均为脐血成功植入的患者。UCBT从植入时开始每周利用荧光定量PCR技术检测患者全血标本中的CMV-DNA拷贝数,根据有无发生CMV感染将患者分为两组。使用五色和四色流式细胞仪检测两组患者植入时、1月、2月、3月、6月、1年、2年、3年的NK细胞表型及受体谱的变化和重建情况,分析两组之间的差异,分析CMV感染患者的NK细胞表型及受体谱的重建特点。结果一、临床结果1.CMV感染情况：CMV阳性组38例患者,CMV阴性组38例患者,CMV感染发生时间为32(18-125)天。与文献报道一致,CMV阳性患者在CMV-DNA拷贝数大于103给予治疗,首选的治疗药物为更昔洛韦及膦甲酸钠,经过抗病毒治疗后所有患者CMV-DNA均转阴,中位转阴时间为15(7-29)天,没有患者发生CMV病。2.脐血移植物特征及造血恢复情况：因研究需要,选择的病例均为脐血成功植入的患者,其中CMV阳性组所含有核细胞数为3.9(2.0～15.4)×107/kg,CD34+细胞数2.7(1.2～28.4)×105/kg,CD56+细胞数1.5(0.38～10.4)×106/kg,CD3+细胞数2.6(0.77～11.8)×106/kg。CMV阴性组所含有核细胞数为4.3(2.1～16.2)×107/kg,CD34+细胞数2.9(1.3～29.3)×105/kg,CD56+细胞数1.6(0.35～11.0)×106/kg,CD3+细胞数2.5(0.8～12.0)×106/kg。CMV阳性组粒细胞植入中位时间为19(12～39)天,血小板植入的中位时间为32(14～79)天。CMV阴性组粒细胞植入中位时间为18(13～38)天,血小板植入的中位时间为35(15～83)天。两组在移植物特征及造血恢复时间方面均无差异,p均大于0.05。3.植入前综合征(Pre-engraftmentsyndrome,PES)的发生情况：共发生PES53例(69.7%),其中CMV阳性组29例(76.3%),CMV阴性组24例(63.2%),两组无差异,p=0.21。PES发生的中位时间两组均为移植后7(5-15)天,均治疗后好转。4.急性移植物抗宿主病(Graft-versus-hostdisease,GVHD)的发生情况：CMV阳性组共发生急性GVHD15例,其中Ⅰ度GVHD6例(15.8%)、Ⅱ度GVHD6例(15.8%)、Ⅲ度GVHD2例(5.3%)、Ⅳ度GVHD1例(2.6%)；CMV阴性组发生急性GVHD12例,其中Ⅰ度GVHD4例(10.5%)、Ⅱ度GVHD6例(15.8%)、Ⅲ度GVHD2例(5.3%)、Ⅳ度GVHD0例(0.0%)。两组在急性GVHD发生率方面无差异,p均大于0.05。5.慢性GVHD的发生情况：CMV阳性组36例可评估的患者中发生4例慢性GVHD(11.1%),3例为局限型,1例死亡,CMV阴性组34例可评估的患者中发生3例慢性GVHD(8.8%),均为局限型,两组比较差异无显著性,p=1.0。6.细菌及真菌感染情况：24例(31.6%)患者在移植后发生程度轻重不一的细菌及真菌感染,CMV阳性组为13例,CMV阴性组为11例,p=0.62。共发生细菌血流感染21例,包括大肠杆菌6例,肺炎克雷伯杆菌4例,缓征链球菌3例,粪肠球菌2例,白色葡萄球菌2例,草绿色链球菌1例,铜绿假单胞菌1例,小肠耶氏菌1例,丹毒丝菌1例。发生肺部侵袭性真菌感染3例。重症感染导致死亡的患者9例(11.8%),包括3例肺部侵袭性真菌感染和6例细菌感染患者,其中CMV阳性组5例,CMV阴性组4例,p=1.0。两组在细菌及真菌感染及死亡率方面均无统计学差异。7.复发情况：随访至2014年3月1日,所有患者平均随访时间为518(59～2357)天,生存患者平均随访637(206～2357)天。共11例(14.5%)复发,均为高危患者,其中CMV阳性组4例(10.5%),CMV阴性组7例(18.4%),p=0.33,两组复发率比较无统计学差异。其中复发起源于骨髓的有6例,起源髓外的有5例。复发的患者中死亡的有6例,带病生存的患者有5例。8.死亡及生存情况：截至2014年3月1日,共18例患者死亡,其中CMV阳性组10例,CMV阴性组8例,p=0.59,两组无统计学差异。死亡原因为细菌及真菌感染9例、复发6例、急性GVHD1例、慢性GVHD1例、其他原因1例。3年总生存率(Overallsurvival,OS)为74.1%,3年无事件生存率(Event-freesurvival,EFS)为66.8%。其中CMV阳性组和CMV阴性组的OS分别为68.3%和78.6%,p=0.56,CMV阳性组和CMV阴性组的EFS分别为61.0%和70.3%,p=0.82,均无统计学差异。二、NK细胞免疫重建结果1.淋巴细胞比例及绝对值变化：76例患者在UCBT后+60天淋巴细胞绝对值和比例均达到正常值水平,CMV阳性组和CMV阴性组在淋巴细胞比例和绝对值的比较无统计学意义,p均大于0.05。2.NK细胞比例和绝对值重建情况：两组患者NK细胞占淋巴细胞比例均在造血植入时达到高峰,然后出现下降,但CMV阳性组较CMV阴性组下降缓慢,CMV阳性组比CMV阴性组NK细胞比例在移植后30天(32.3%±15.7VS20.3%±12.4,p=0.02)及60天(23.4%±12.8VS12.3%±6.5,p=0.04)明显升高,有统计学意义。CMV阳性组比CMV阴性组NK细胞绝对值在移植后30天(20.4×107/L±10.3VS10.2×l07/L±4.3,p=0.02)及60天(46.5×107/L±21.2VS23.4×107/L±11.05,p=0.02)明显升高,有统计学意义。3.CD3-CD56brightNK细胞的重建:UCBT后+30天及+60天,CMV阴性组的CD3-CD56brightNK细胞比例形成高峰,后逐渐下降至正常,但CMV阳性组未形成明显高峰,故CMV阳性组的CD3-CD56brightNK细胞比例在+30天和+60天较CMV阴性组的CD3-CD56brightNK细胞比例明显减少,分别为(12.4%±5.7VS.2VS26.8%±9.5,p=0.02)。因UCBT后+30天和+60天CMV阳性组的NK细胞绝对值较高,CMV阳性组与CMV阴性组在CD3-CD56brightNK细胞绝对值方面无明显差异。CMV阳性组与CMV阴性组CD57+CD3-CD56bright、CD11b+CD3-CD56bright及CD27+CD3-CD56bright的表达比例及细胞绝对值均无明显差异。4.CD3-CD56-CD16+细胞：CMV阳性患者与CMV阴性患者相比,CD3-CD56-CD16+细胞比例在+30天和+60天明显增加,分别为(17.6%±4.3VS8.1%±2.7,p=0.02)和(14.4%±2.9VS7.3%±2.2,p=0.03)。CMV阳性患者的CD3-CD56-CD16+细胞绝对值在+30天和+60天较CMV阴性患者的CD3-CD56-CD16+细胞绝对值明显增加,分别为(10.6×10-/L±3.3VS4.1×107/L±1.3,p=0.01)和(28.8×107/L8.2VS15.5×107/L±6.0,p=0.02),有统计学意义。5.CD57+CD56-CD16+细胞：移植后+30天及+60天,CMV阳性组CD57在CD3-CD56-CD16+NK细胞上的表达比例较CMV阴性组升高,分别为(14.5%±4.2VS5.9%±1.7,p=0.02)和(20.9%±8.9VS6.8%±2.2,p=0.01),CMV阳性组CD3-CD56-CD16+CD57+细胞绝对值在移植后+30天(15.4×106/±3.3VS3.1×106/L±1.3,p=0.01)及+60天(60.2×106/L±11.2VS10.5×106/L±9.0,p=0.001)也明显高于CMV阴性组,CD11b及CD27表达无明显差异。6.NKG2D受体的重建：与CMV阴性组相比,CMV阳性组的NK细胞表面的NKG2D受体重建加快。在移植后+30天和+60天,CMV阳性组的NKG2D比例明显高于CMV阴性组,分别为(84.6%±10.3VS56.8±8.2,p=0.02)和(92.1%±9.9VS62.3%±11.6,p=0.02).在移植后+30天和+60天,CMV阳性组的NKG2D受体绝对值也明显高于CMV阴性组,分别为(11.2×1O7/L±4.3VS5.7×107/L±2.3,p=0.04)和(42.8×107/L±11.2VS14.6×107/L±6.0,p=0.01).7.NKG2A受体的重建：CMV阳性组与CMV阴性组NKG2A受体比例均在植入时达到高峰,逐渐下降至稳定水平。与CMV阴性组相比,CMV阳性组的NK细胞表面的NKG2A比例下降更快。在移植后+30天,CMV阳性组的NKG2A比例已明显下降,而CMV阴性组的NKG2A比例在移植后+90天下降至稳定水平。故在移植后+30天和+60天,CMV阳性组的NKG2A比例明显低于CMV阴性组,分别为(44.7%±9.3VS82.1%±14.7,p=0.01)和(43.1%±13.9VS76.8%±15.3,p=0.03)。但是因为CMV阳性组在移植后NK细胞的绝对值重建较快,故CMV阳性组与CMV阴性组在NKG2A受体的绝对值方面无明显差异。8.CD158a(KIR2DL1)受体的重建：CMV阴性组CD158a(KIR2DL1)受体比例重建较快,在移植后+30天达到了正常值水平,CMV阳性组在移植后+90天左右达到正常值水平。故在移植后+30天和+60天,CMV阳性组的CD158a受体比例明显低于CMV阴性组(8.3%±3.8VS17.2%±3.4,p=0.03；7.4%±3.6VS16.8%±4.5,p=0.03)。但是因为CMV阳性组在移植后NK细胞的绝对值重建较快,故CMV阳性组与CMV阴性组在CD158a受体的绝对值方面无明显差异。9.CD158b受体的重建：CMV阳性组及CMV阴性组的CD158b受体比例在植入时均较高,但CMV阳性组在移植后+30天和+60天出现下降,而CMV阴性组在移植后+30天和+60天呈上升趋势。故移植后+30天和+60天,CMV阳性组和CMV阴性组的CD158b占NK细胞的比例分别为(17.3%±7.6VS40.7%±13.7)和(26.4%±8.9VS58.5%±16.5),p均为0.02,均存在显著性差异。因为CMV阳性患者的NK细胞绝对值较高,故CMV阳性组和CMV阴性组的CD158b绝对值无显著性差异。10.NKP46受体的重建：CMV阳性组的NKP46受体在植入时、+30天及+60天所占比例均较高,CMV阴性组NKP46受体在植入时、+30天所占比例均较高,以后逐渐下降至稳定水平。移植后+30天和+60天,CMV阳性组比CMV阴性组的NKP46占NK细胞的比例明显升高,分别为(92.3%±10.4VS65.1%±10.6,p=0.02)和(86.4%±12.1VS58.3%±11.9,p=0.02),有统计学意义。移植后+30天和+60天,CMV阳性组比CMV阴性组的NKP46细胞的绝对值明显升高,分别为(18.8×107/L±5.3VS6.7×107/L±2.3,p=0.01)和(40.2×107/L±12.2VS13.6×107/L±4.0,p=0.01),均有统计学意义。说明CMV阳性组在移植后+30天和+60天NKP46受体的高峰更高。结论CMV感染患者在CMV-DNA拷贝数大于103再进行抗病毒治疗,未增加患者的CMV病发生率及死亡率,生存情况与CMV阴性患者类似,国外有文献报道CMV感染可以减少HSCT后复发率,但可能因为病例数较少的原因,我们的研究中未发现两组在疾病复发率方面有统计学差异,以后可以扩大病例数继续研究。与CMV阴性组相比,CMV阳性组中NK细胞的比例及数量早期重建,代表NK细胞分泌功能的CD3-CD56bright细胞减少,代表NK细胞杀伤功能的CD3-CD56-CD16+细胞的增多,在CD3-CD56-CD16+CD57+在淋巴细胞上的表达升高。活化性受体包指NKG2D、NKP46重建加快、抑制性受体NKG2A、CD158a、CD158b重建减慢,说明CMV感染可以促进NK细胞的成熟,可能提高NK细胞的功能。
【作者】童娟；
【导师】孙自敏；
【作者基本信息】山东大学，内科学（专业学位），2014，博士
【关键词】非血缘脐血移植；巨细胞病毒；自然杀伤细胞；免疫重建；

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