CDH1调控EGFR和DIRAS3表达及功能的机制研究

【摘要】研究背景和目的癌症已经成为人类最主要的致死疾病之一,严重威胁人们的寿命,大多数恶性肿瘤患者死于肿瘤的扩散转移。可见,肿瘤转移的研究对肿瘤治疗有着重要的意义。EGFR属于受体酪氨酸蛋白激酶家族。一旦激活,EGFR细胞内酪氨酸激酶结构域发生磷酸化后激活PI3K,STAT,MAPK,Src等下游信号通路,调控细胞的增殖,存活,迁移和分化等多个生物学过程。EGFR的高表达和过度活化在肿瘤发生及转移中普遍存在。上皮型钙粘素(CDH1/E-cadherin)是介导同型细胞连接的钙依赖的粘附分子,CDH1表达下调通过打破细胞间粘附以及改变基因的转录表达促进癌症的转移。同时,CDH1的缺失参与肿瘤转移的重要步骤EMT的发生。从而,低水平的CDH1与肿瘤的转移,病人的不良预后密切相关。因此,EGFR和CDH1已经成为近年来肿瘤转移研究的热点分子。研究表明CDH1与EGFR这间存在相互调控,两者之间的相互作用影响多种癌症的发生发展。EGFR通过上调CDH1转录抑制因子Twist和Slug的表达,下调CDH1进而促进癌症细胞的EMT转换能力。另外,CDH1介导的细胞连接和其胞外结构域与EGFR的相互作用影响EGFR的活化及下游信号转导。然而,CDH1对EGFR表达影响的研究较少。最近的一项研究表明,在头颈癌细胞中CDH1表达下调能够转录激活EGFR的表达,最终促进头颈癌细胞的增殖。但是,在肺癌细胞中CDH1表达下调影响EGFR表达的分子机制并不清楚。YBXl作为一种癌蛋白不仅在包括肺癌在内的多种肿瘤细胞中过表达而且作为肺癌进展的标志性分子受到人们的广泛关注。研究表明,YBX1与EGFR的表达调控密切相关。在乳腺癌细胞中,YBX1能够与EGFR的启动子直接结合进而促进EGFR的转录表达,而这一表达调控依赖于YBX1S102的磷酸化。AKT作为丝氨酸苏氨酸激酶能够磷酸化YBX1第102位丝氨酸,使YBX1发生核转位进而促进其行使转录因子的功能。以上研究报道提示我们CDH1表达下调所引起的EGFR表达上调可能通过AKT信号通路活化YBX1进而调控EGFR的表达。DIRAS3是GTP结合Ras样蛋白,它作为肿瘤抑制基因在卵巢癌和乳腺癌细胞中表达下调。同时,DIRAS3的过表达能够削弱卵巢癌和乳腺癌细胞的增殖、自噬、凋亡和迁移。在我们的研究中发现CDH1表达下调促进乳腺癌细胞中DIRAS3的转录表达,但是其具体的调控机制并不清楚。综上所述,目前对肿瘤细胞中CDH1调控EGFR和DIRAS3表达的精细分子机制还不清楚,因而,有必要对这一问题进行研究。在本论文中我们利用细胞生物学和分子生物学的方法,研究肿瘤细胞中CDH1调控EGFR和DIRAS3表达的分子机制以及功能机制,期望以此了解肿瘤细胞转移过程中关键分子的调控网络,为开发具有高度特异性、更加高效的抗肿瘤药物提供新的靶标和肿瘤治疗策略。研究内容及研究成果1.CDH1表达下调诱导EGFR表达的分子机制研究在人的非小细胞肺癌细胞中,利用siRNA干扰抑制CDH1的表达或通过病毒感染稳定沉默CDH1的表达发现,短期或长期沉默CDH1都能够上调EGFR的表达。并且,瞬时过表达CDH1或通过病毒感染稳定表达CDH1后,EGFR的表达水平明显降低。进一步的RT-PCR结果显示,抑制CDH1的表达能够显著上调EGFR转录水平的表达。从而表明CDH1表达下调在转录水平诱导EGFR的表达。随后探究转录因子YBX1是否参与CDH1调控EGFR表达的过程。在稳定抑制CDH1表达的A549shCDH1和HI650shCDH1细胞中检测p-YBX1的水平,发现YBX1的磷酸化水平升高。并且,瞬时过表达CDH1或通过病毒感染稳定表达CDH1后,YBX1的磷酸化水平降低,表明CDH1表达下调能够激活YBX1。为了进一步检测CDH1表达下调所引起的EGFR表达上调是否依赖于YBX1的活化,我们利用siRNA干扰技术抑制CDH1表达的同时沉默YBX1的表达,发现抑制YBX1的表达能够削弱由CDH1沉默所引起的EGFR的表达上调。这些实验数据表明,CDH1表达下调所诱导的EGFR的表达依赖于转录因子YBX1的激活。接下来的实验进一步探究磷酸化的YBX1能否直接结合到EGFR启动子上调控EGFR的表达。利用包含不同突变形式的EGFR1kb启动子的荧光素酶报告质粒进行实验发现,与野生型的EGFR启动子相比,1b和2a两个YRE位点的突变削弱了由CDH1沉默所引起的EGFR启动子的活性的增强。同时,利用YBX1的相应抗体进行ChIP实验,结果显示沉默CDH1表达后,YBX1与EGFR启动子区的结合明显增加。以上实验表明,在人的非小细胞肺癌细胞中抑制CDH1的表达能够磷酸化YBX1,并且通过引起YBX1与EGFR启动子区结合的增加上调EGFR的转录表达。研究表明AKT信号通路能够诱导YBX1第102位丝氨酸的磷酸化,使其发生核转位进而调控基因的转录表达。但是CDH1表达下调能否激活AKT信号通路并不清楚。在稳定抑制CDH1表达的A549shCDH1和H1650shCDH1细胞中检测p-AKT的水平发现与对照细胞相比AKT的磷酸化水平升高。并且,瞬时过表达CDH1或通过病毒感染稳定表达CDH1后,AKT的磷酸化水平降低,表明CDH1表达下调能够激活AKT信号通路。为了进一步确定AKT信号通路在CDHl表达下调所引起的YBX1诱导EGFR表达中的作用,我们利用siRNA干扰技术抑制AKT的表达后发现,YBX1的磷酸化水平明显降低并且伴随着EGFR表达的下调。综上所述,CDH1表达下调能够激活AKT信号通路进而磷酸化YBX1,最终上调EGFR的表达。2.CDH1表达下调诱导EGFR表达的功能研究EGFR作为受体酪氨酸蛋白激酶家族的重要成员,在胞外信号向胞内传递的过程中发挥重要作用。EGFR受体过表达时,能够导致EGFR配体非依赖的激活。而CDH1表达下调能够诱导EGFR蛋白水平的表达,因此我们检测CDH1表达下调后EGFR下游信号通路的活化情况。实验发现不管短时沉默CDH1的表达(12h和24h),还是长时抑制CDH1的表达(72h),都能够活化c-Jun、ERK口Sre,激活EGFR下游信号通路。利用siRNA干扰技术抑制CDH1的表达或通过病毒感染稳定沉默CDH1表达后,一方面进行细胞增殖实验,发现抑制CDHl的表达能够显著增强肺癌细胞的增殖；另一方面进行细胞划痕实验和细胞侵袭实验,发现CDH1表达下调能够促进肺癌细胞的迁移和侵袭。我们的数据表明,CDH1表达下调也许通过调控YBX1和(?)EGFR促进肿瘤进展和转移。因此,我们进一步探究靶向抑制YBX1和EGFR的表达对CDH1表达下调所引起的肺癌细胞的高增殖和高转移能力的影响。在肺癌细胞中抑制CDH1表达的同时,分别抑制YBX1和EGFR的表达。通过细胞增殖实验,细胞划痕实验和细胞侵袭实验发现,沉默YBX1和EGFR的表达能够削弱CDH1下调所引起的肺癌细胞增殖,迁移和侵袭能力的增强。并且,在稳定抑制CDH1表达的A549shCDH1细胞中进行相同的实验,我们得到了相同的实验结果。3.CDHl表达下调诱导DIRAS3表达的分子机制研究沉默CDH1的表达后进行基因芯片分析发现,CDH1表达下调促进DIRAS3基因的转录表达。为了验证这一发现,我们在MCF7细胞中转染CDH1siRNA,RT-PCR结果显示MCF7细胞中沉默CDH1的表达可以显著上调DIRAS3转录水平的表达。基于CDH1通过YBX1调控EGFR的实验结果,我们推测在MCF7细胞中CDH1表达下调是否同样通过激活转录因子YBX1调控DIRAS3的表达。首先,在MCF7细胞中沉默CDH1的表达后,检测发现YBX1的磷酸化水平和DIRAS3的表达明显增加。随后,在MCF7和MDA-MB-231细胞中过表达YBX1,发现YBX1过表达能够增加DIRAS3转录水平和蛋白水平的表达。同时,抑制MCF7和MDA-MB-231细胞中YBX1的表达能够降低DIRAS3的表达。这些实验数据表明,CDH1表达下调所诱导的DIRAS3的表达上调依赖于转录因子YBX1。接下来,进一步探究YBX1作为转录因子能否与DIRAS3的启动子结合。利用YBX1的相应抗体进行ChIP实验发现,加入YBX1抗体的实验组中YBX1与D1RAS3启动子区YREs的结合明显增加。随后,在MCF7细胞中转染CDH1siRNA12小时后进行ChIP实验。结果显示沉默CDH1表达后,YBX1与DIRAS3启动子区3个YREs位点的结合增加,分别是-218360,-809——907和-984——1173。以上数据表明,在乳腺癌细胞中抑制CDH1的表达能够磷酸化YBX1,并且能够引起YBX1与DIRAS3启动子区结合的增加进而上调DIRAS3的转录表达。综上所述,在乳腺癌细胞中,CDH1表达下调能够激活转录因子YBX1,进而上调DIRAS3的转录表达。结论1.在肺癌细胞中,CDH1表达下调能够激活AKT信号通路进而磷酸化YBX1,最终在转录水平上调EGFR的表达。2.CDH1表达下调引起EGFR表达增加后激活EGFR下游信号通路,并且CDH1表达下调能够促进肺癌细胞的增殖和转移。3.靶向抑制YBX1和EGFR能够削弱CDH1表达下调所引起的肺癌细胞的高增殖和高转移能力。4.在乳腺癌细胞中,CDH1表达下调能够激活转录因子YBX1,进而上调DIRAS3的表达。
【作者】刘现芳；
【导师】刘相国；
【作者基本信息】山东大学，细胞生物学，2014，博士
【关键词】CDH1；EGFR；YBX1；DIRAS3；肿瘤转移；

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