mitoK_(ATP)通道在七氟烷后处理糖尿病脑缺血大鼠神经保护中的作用研究

【摘要】研究背景糖尿病是一种危害性极大的疾病,世界上有超过2.2亿名糖尿病患者。流行病学研究表明糖尿病是缺血性卒中一个高危因素,是导致人类死亡和永久性残疾的主要原因之一。此外,糖尿病使缺血性损伤更严重,使神经损伤加重并使神经功能恢复困难。因此,研究糖尿病患者缺血性脑损伤的机制和探索更有效的神经保护治疗是最近几年医学研究的热点。但是,临床中能减少糖尿病患者缺血性脑损伤的治疗措施很少。越来越多的研究表明使用吸入性麻醉药预处理或后处理会减轻缺血性脑损伤,其机制被认为与缺血预处理或缺血后处理类似。尽管缺血预处理或吸入麻醉剂预处理能够有效保护缺血性脑损伤,但是由于临床上缺血性发作大多是不可预测的,所以其在临床上的应用会受到限制。然而缺血后再灌注损伤往往是可预测的,因此,采用缺血后处理,通过影响再灌注的进程,在临床上是可行的选择。但是使用短时间反复再灌注／再闭塞循环操作的后处理方法,对脑缺血患者可操作性差,并可能会对患者造成严重后果,因此临床中最常采用药物做缺血后处理。七氟烷作为一种全身麻醉常用药物,尤其适合需要做脑部全麻手术的患者。迄今为止,大多数吸入麻醉剂后处理神经保护作用的研究在健康的动物中进行,但是尚未见高血糖或者糖尿病吸入麻醉剂后处理神经保护作用研究的报道。因此糖尿病是否会影响七氟烷后处理的神经保护作用仍然不清楚。已经证实在脑缺血性损伤中线粒体KATP(mitoKATP)通道对保护脑神经起着重要的作用。最新的研究表明在局灶性脑缺血大鼠模型中七氟烷后处理的神经保护作用依赖于mitoKATP通道的开放。另外一些研究发现高血糖或者糖尿病大鼠中大脑和外周组织中mitoKATP通道的表达会减少。因此,本研究的目的是验证糖尿病脑线粒体KATP通道的减少是否会加重缺血性脑卒中引起的脑损伤和减弱七氟烷后处理诱导的神经保护作用。此外,我们还研究了使用胰岛素治疗高血糖后是否会恢复七氟烷后处理的神经保护作用。第一部分动物实验方法制备糖尿病(DB)大鼠模型：腹腔注射溶于0.5mol/1柠檬酸盐缓冲液(pH4.5)的链脲霉素(STZ,Sigma,St.Louis,MO),剂量为40mg/kg.24小时后再次注射同等剂量STZ。在注射STZ之前和注射3天后,使用血糖仪(PrestigeSmartSystem)监测鼠尾静脉血糖水平,之后每周进行血糖监测,为期8周。在第二次注射STZ之后3天内血糖水平大于300mg/dl的大鼠被认为是患有糖尿病。腹腔注射柠檬酸盐缓冲液的大鼠作为非糖尿病组(Non-DB).非糖尿病和糖尿病大鼠随机分成10组(n=8只),具体如下：(1)非糖尿病缺血再灌注对照组(Non-DB-Con)；(2)非糖尿病七氟烷后处理组(Non-DB-Sev);(3)非糖尿病七氟烷后处理加5-羟基葵酸盐(5-HD)组(Non-DB-5HD+Sev),与组(2)一样,但是另外加用mitoKATP通道阻滞剂5HD,在七氟烷后处理前30分钟腹腔注射5HD(40mg/kg)；(4)非糖尿病二氮嗪(DZX)组(Non-DB-DZX).再灌注前30分钟,腹腔注射mitoKATP通道开放剂DZX,(10mg/kg)；(5)糖尿病缺血再灌注对照组(DB-Con)；(6)糖尿病七氟烷后处理组(DB-Sev)；(7)糖尿病七氟烷后处理加5-羟基葵酸盐(5-HD)组(DB-5HD+Sev)；(8)糖尿病二氮嗪(DZX)组(DB-DZX)；(9)胰岛素治疗DB缺血再灌注对照组(Ins-DB-Con),与组(5)一样,另外这些糖尿病大鼠在缺血再灌注4周前会皮下注射胰岛素5U／天,为期4周；(10)胰岛素治疗DB七氟烷后处理组(Ins-DB-Sev),与(6)相同。在STZ注射后8周,对这些大鼠进行缺血再灌注的研究。在稳定30分钟后,所有的大鼠在2h的局灶性脑缺血后,行再灌注24小时。接受七氟烷后处理的大鼠放置在密闭的动物箱中,在再灌注开始后,把其立即暴露在浓度为2.6%的七氟烷中,为期15分钟。气体分析仪与密封箱相连接以监控和维持吸入氧气和七氟烷的浓度。七氟烷的剂量选择根据以前的研究而定,即以在活体大鼠产生最优的神经保护作用为准。缺血再灌注24小时后,对大鼠神经功能缺损和运动协调性进行详细评分。然后大鼠被处死,收集血液样本进行生化检测,摘除大脑测算脑梗死体积。结果七氟烷后处理或DZX对神经损伤的影响缺血2h/再灌注24小时后,糖尿病大鼠对照组的脑梗死体积明显大于非糖尿病大鼠对照组(32±3%*vs.21±2%,DB-Convs.Non-BD-Con,*P<0.05)非糖尿病大鼠中,七氟烷后处理或mitoKATP通道开放剂DZX都减少了脑梗死体积,但是在糖尿病大鼠中无论是七氟烷后处理还是DZX都未能减少脑梗死体积。此外,在七氟烷后处理之前使用mitoKATP通道阻滞剂5-HD会完全抑制七氟烷后处理对非糖尿病大鼠的保护作用,但是对糖尿病大鼠没有影响(图1)。缺血前,组间在转棒上停留时间不存在显著差异(平均停留时间为153±11sec)。缺血24小时后,每组的神经功能缺损评分和平衡协调表现如表2所示。与非糖尿病对照大鼠相比,糖尿病大鼠在缺血24小时后神经功能缺损评分(图2A)更高,在转棒上停留时间(图2B)减少。非糖尿病鼠中,七氟烷后处理和DZX同样降低神经功能缺损评分,增加转棒上停留的时间(P<0.05vs.Non-BD-Con),但是在用5-HD处理后,七氟烷后处理的有利的效果减少。相比之下,糖尿病大鼠中,经过七氟烷后处理和DZX或者5-HD处理后,无论是神经功能缺损评分还是平衡协调表现都没有发生改变(vs.DB-Con)。与未经处理的糖尿病大鼠相比,接受过4周胰岛素治疗的糖尿病大鼠脑梗死体积明显减小(24±2%*vs.32±3%,Ins-DB-Convs.BD-Con,*P<0.05)(图1)。此外,与未经处理的糖尿病大鼠相比,经过胰岛素治疗的糖尿病大鼠的神经功能缺损评分也较低(图2A),转棒上停留的时间更长(图2B)。并且,与经胰岛素治疗的大鼠相比,经过七氟烷后处理的大鼠,脑梗死体积进一步减少,神经功能缺损评分降低,平衡协调表现提高。脑mitoKATp通道表达实时PCR和Westernblot显示在注射STZ8周后,非糖尿病大鼠和糖尿病大鼠大脑中均检测到Kir6.2和SUR1的mRNA和蛋白表达。糖尿病大鼠大脑中Kir6.2mRNA(图3)和蛋白表达(图4)水平明显低于非糖尿病大鼠(P<O.05)。然而,两组间SUR1mRNA和蛋白表达不存在明显差异。经4周胰岛素治疗的糖尿病大鼠Kir6.2mRNA和蛋白表达正常化,但是没有改变大脑中SUR1的表达。脑KATP通道免疫染色激光共焦显微镜观察表明与非糖尿病大鼠相比,糖尿病大鼠中的大脑皮层Kir6.2免疫反应性显著降低(图5)。经4周的胰岛素治疗后,糖尿病大鼠大脑中Kir6.2免疫反应性增加。相反,三个实验组大脑皮层SUR1免疫反应性相似。第二部分细胞实验方法选择出生后24h的Sprague-Dawley大鼠,取大脑皮质细胞培养。在倒置相差显微镜下定时观察细胞形态及生长情况。于培养第7d开始实验。分为①正常对照组：正常更换细胞培养液,制备OGD/R模型时同步更换为含糖(33mmol/L)Earle’s平衡盐缓冲液。②缺氧缺糖再灌注损伤模型组：神经细胞于培养第7天后吸出培养基,以无糖Earle’s平衡盐缓冲液洗细胞2次并将DMEM/F12培养液全量替换；然后置于缺氧箱内充以95%氮气,5%二氧化碳,37℃培养2h后,取出并去除平衡盐缓冲液,换以含血清的DMEM/F12完全培养基置入C02培养箱孵育24h,以缺氧缺糖再灌注损伤模拟脑缺血再灌注损伤的过程。③挥发性麻醉剂后处理组：细胞按上述方法造模,将造模后的细胞立即置于分别含1%、2%和3%七氟烷密封箱中。经过3-5min,密封箱中挥发性麻醉剂浓度达标时,关闭密封箱的入口和出口后,置于37℃含95%空气和5%二氧化碳湿化混合气培养箱中孵育1h,取出后置于相同环境培养箱中孵育19h。结果神经细胞形态学观察结果：神经细胞缺氧缺糖再灌注损伤后形态观察：缺氧缺糖损伤后,神经细胞形态学和存活率变化明显,胞体肿胀或变形,突起渐渐缩短,光晕明显消失,再灌注24h后神经细胞胞体萎缩,折光性下降趋于崩解,突起明显缩短,颗粒样物质增多,部分细胞胞体甚至完全崩解；七氟烷药物处理组神经细胞形态改变减轻,胞体完整,突起较清楚,基本保持完整。MTT比色分析法比较各组神经细胞细胞活性：通过MTT比色法测定神经细胞活性,将对照组细胞线粒体活性设为100%,缺氧缺糖再灌注损伤后神经细胞线粒体活性比正常对照组细胞活性降低24.5%(P<0.05),实验数据表明缺氧缺糖再灌注损伤可明显造成神经细胞损伤；同时,不同浓度七氟烷处理组与缺氧缺糖再灌注损伤模型组相比较,七氟烷能够明显提高神经细胞线粒体活性(P<0.05),并且随剂量的增加,线粒体活性具有增强的趋势。缺氧缺糖再灌注损伤引起的神经细胞LDH的释放检测：将对照组培养液中的乳酸脱氢酶活性作为100%,缺氧缺糖再灌注损伤组乳酸脱氢酶释放达到约146%(P<0.05)；不同浓度七氟烷处理组表现出剂量依赖性的降低神经细胞LDH的释放。结论七氟烷后处理能增加缺氧缺糖在灌注神经细胞的线粒体活性,并能降低神经细胞LDH的释放；减少脑KATP通道加剧糖尿病大鼠的缺血性脑损伤并使七氟烷后处理所产生的神经保护作用失效。使用胰岛素控制血糖可通过调节脑mitoKATP通道恢复七氟烷后处理的神经保护作用。
【作者】李东亮；
【导师】李新钢；
【作者基本信息】山东大学，外科学（专业学位），2014，博士
【关键词】糖尿病；七氟烷后处理；脑卒中；脑损伤；线粒体KATP通道；

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