B基因型和C基因型HBV转录活性差异的机制研究

【摘要】目前全世界大约有3.5亿人群感染了乙型肝炎病毒（HBV），HBV属于嗜肝病毒，在复制周期中需要以前基因组RNA（pgRNA）为模板逆转录成共价闭合环状DNA（cccDNA），而逆转录酶缺少校对功能，因此在复制过程中容易发生碱基突变，从而形成不同的准种。当病毒基因组的核苷酸差异大于8%时，即形成了不同的基因型。根据HBV全基因组序列的差异，HBV可以分为10种主要的基因型（A-J），这10种基因型在全世界呈地域性分布，我国最常见的是基因型B和C。在临床上，HBV前C区（PC）G1896A突变和核心启动子区（BCP）A1762T/G1764A突变可分别会减弱和阻断HBeAg的表达，常见于HBeAg阴性慢性乙型肝炎（CHB）患者；与B基因型慢性HBV感染者相比，C基因型感染者的BCP区突变率较高，HBV活动性复制的持续时间较长，HBeAg血清学转换时间较晚，且更容易发展至终末期肝病和肝细胞肝癌（HCC）。在HBeAg阳性的慢性乙型肝炎患者中，基因型C患者的HBVDNA滴度和HBeAg滴度较高，且更容易发生BCP区A1762T/G1764A突变，而基因型B更容易发生前C区G1896A突变。近年来，国内外对来源于B和C基因型CHB患者的临床分离毒株的生物学特性报道较少。Qin等通过体外分析的方法发现BCP区未发生A1762T/G1764A突变的基因型CpcRNA和前基因组RNA（pgRNA）的转录水平比基因型B低，BCP区发生A1762T/G1764A突变的基因型C转录水平均明显增强，在野毒株BCP区人为的引入A1762T/G1764A双突变也可以明显增强HBV的转录水平。因为核心启动子直接启动pgRNA和pcRNA的转录，进而影响基因组复制，根据以上研究结果我们假设核心启动子的活性是影响B基因型和C基因型HBV转录活性差异的主要因素，本实验中我们对以上假设开展了三部分的研究工作。第一部分研究是B基因型和C基因型HBV核心启动子区序列分析。我们从Genbank下载了453条B基因型HBV全基因序列、525条C基因型序列；另外从慢乙肝患者血清中抽提HBV基因组，构建病毒群全基因质粒，测定基因型，然后挑取100条B基因型和100条C基因型单克隆质粒。用VectorNTI软件比对两种基因型样本的核心启动子序列，结果发现：（1）B基因型HBV有32%存在A1762T/G1764A突变，C基因型HBV有68%存在A1762T/G1764A突变。（2）B基因型和C基因型核心启动子区在nt1633、nt1635、nt1636、nt1652、nt1673、nt1730的位置存在差异，并且碱基类型与基因型有关。第二部分的工作主要是对B基因型和C基因型HBV标本的核心启动子活性进行分析。我们通过构建pGL2表达质粒，分析外源性启动子对pGL2表达萤火虫（Fluc）和海肾荧光素酶（Rluc）的影响。我们在nt1611-nt1632之间设计一条包含SacI酶切位点的上游引物，在nt1862-nt1886之间设计一条包含HindIII酶切位点的下游引物，PCR扩增启动子片段，构建含有HBV核心启动子序列的pGL2重组质粒，将质粒转染至Huh7和HepG2细胞系，通过双荧光素酶报告系统分析Fluc/Rluc的比值来反映外源性启动子活性。结果发现：（1）在Huh7和HepG2细胞系中HBVB基因型核心启动子活性显著强于C基因型（P<0.05）。（2）相同基因型的标本之间的核心启动子活性存在差异，对应的核心启动子序列也不相同。（3）核心启动子活性和HBV体外转录活性相关。该结果初步验证了HBV基因型B和基因型C启动子活性的差异是影响这两种基因型体外转录活性差异的主要因素的假设。在第三部分中，根据本研究第一部分HBV基因型B和C启动子区序列比对结果，我们采用定点突变的方法对上述构建的pGL2质粒中HBV基因型B和基因型C启动子区进行定点突变，把nt1633、nt1635、nt1636、nt1652、nt1673、nt1730位置的碱基突变成另一种基因型相同位点的碱基类型，然后分析碱基突变前后双荧光素酶表达的变化。结果发现：（1）nt1633、nt1635、nt1636、nt1652联合突变时，B基因型核心启动子活性明显减弱，C基因型核心启动子活性明显增强。（2）nt1673和nt1730分别突变后对B基因型核心启动子活性影响差异不显著，对C基因型核心启动子活性影响显著。结果进一步说明了上述碱基位点对核心启动子的活性影响较大，核心启动子活性是影响B基因型和C基因型HBV体外转录活性差异的主要因素。
【作者】周学士；
【导师】赵卫峰；张继明；
【作者基本信息】苏州大学，传染病学（专业学位），2014，硕士
【关键词】乙型肝炎病毒；基因型；转录；核心启动子活性；突变；

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