钙调磷酸酶调节因子1通过增强内质网中的N端糖基化上调β淀粉样蛋白的生成

【摘要】唐氏综合症(Downsyndrome,DS)是最常见的人类遗传性疾病之一,以先天性认知功能缺陷,痴呆,学习记忆能力低下以及先天性心脏病,白血病高风险为主要临床表现。随着年龄的增长,罹患DS的病人大脑中都不可避免地检测到类似于阿尔茨海默病(Alzheimerdisease,AD)的神经病理特征,包括神经毒性斑块,神经纤维缠结和神经元死亡。因此,通过研究DS的分子病理基础以探寻AD的发病机制是很有意义的。DS的遗传学病因主要是携带了三倍体的21号染色体的全长或部分,位于21号染色体的21q22.1～21q22.3区域被称为“唐氏综合症关键区域(Downsyndromecriticalregion,DSCR)”,DSCR1是临近这个区域21q22.12所表达的蛋白,其过量表达被认为是DS症状的主要分子病理病因。DSCR1又被称为钙调磷酸酶调节因子1(Regulatorofcalcineurin1,RCAN1),其可与酶亚基A相互结合,从而降低了钙调磷酸酶的活性,导致下游底物活化T细胞核因子(NuclearfactorofactivatedTcells,NFAT)脱磷酸化作用减弱,不能转移到核内。RCAN1-钙调磷酸酶-NFAT信号通路失衡被认为与DS发病的分子机制之一。研究发现,DS患者大脑中钙调磷酸酶的活性明显降低,同样,在AD患者中钙调磷酸酶的活性也显著下降,致使tau蛋白高度磷酸化,形成具有AD病理特征性的神经纤维缠结。有报道发现在DS和AD患者大脑中RCAN1均被检测到有过量表达,约为正常人的2-3倍。这些研究均提示RCAN1可能在DS和AD的发病机制中起关键作用。具有神经毒性的β淀粉样蛋白(Amyloid-βpeptide,Aβ)在脑中的沉积被认为是AD的标志性病理现象之一。Ap主要是由p分泌酶和Y分泌酶依次酶切β淀粉样蛋白前体蛋白(Amyloid-βprecursorprotein,APP)而产生。p分泌酶1(Beta-siteAPP-cleavingenzyme1,BACE1)是最主要的p分泌酶,其可酶切APP的两个位点形成具有99或89个氨基酸的C末端片段(C99,C89),在病理情况下,C99被γ分泌酶进一步酶切,产生Aβ和C末端小片段。而在生理情况下,APP主要由α分泌酶在Aβ区域内部酶切,形成具有83个氨基酸的C末端片段(C83),C83进而被γ分泌酶酶切,生成无毒性的p3和C末端小片段。BACE1从产生到成熟经历了复杂的翻译后加工过程,其中包括了4个位点的N端糖基化(Asn153,172,223,354)。γ分泌酶是一组蛋白复合体,其中多个亚基同样为N端糖基化蛋白。研究表明,BACE1的糖基化程度与其成熟度和活性密切相关,而γ分泌酶亚基的成熟度下降也会导致整个复合体的酶活性降低。有报道发现在DS患者中,成熟型的BACE1过量表达,可能是导致DS患者脑中Aβ沉积,出现类似于AD的痴呆症状的主要原因。然而,导致成熟型的BACE1表达上调的机制尚不清楚。RCAN1已被认为和神经纤维缠结、神经元凋亡等多种神经退行性病变的分子病理机制相关。我们的研究发现,上调RCAN1可以促使BACE1和γ分泌酶活性亚基NCT(Nicastrin)在内质网中的N端糖基化增加,成熟形态的蛋白过度表达。N端糖基化是一种复杂的翻译后加工过程,在内质网中主要受到寡糖转移酶复合体(Oligosaccharyltransferase,OST)调控。OST主要催化核心寡糖链转移至内质网中新合成肽链的天冬酰胺残基上形成N-糖苷键,从而完成了N端糖基化的起始关键步骤之一。本研究发现RCAN1可以与OST的亚基之一,核糖体结合蛋白1(RibophorinI,RPNI)直接作用,上调了OST的酶活性。因此高表达RCAN1可以促使多种N端糖基化蛋白成熟度增加,过度成熟的BACE1和NCT均参与了对APP的酶切过程,最终导致Ap的表达上升,产生一系列的神经退行性症状。本文进一步阐明了RCAN1在DS发病中的关键作用,为探讨AD的分子病理基础提供了一条新思路。本研究不仅从一个新的角度诠释了RCAN1这一高度保守的关键基因在生命体中的重要功能,也对治疗AD患者的临床症状提供了一个新的药物靶点。第一部分RCAN1上调BACE1在内质网中的N端糖基化为了验证RCAN1是否影响BACE1的糖基化,我们首先在体外实验中使用pRCAN1-myc和pBACE1-mycHis质粒共同转染HEK293细胞。人类BACE1含有4个N端糖基化位点,由于糖基化程度的不同,在SDS-PAGEWestenBlot检测中呈现出成熟型和非成熟型两条条带。我们发现RCAN1对成熟型和非成熟型的BACE1都有显著的上调作用。同时,使用N端糖基化阻断剂衣霉素(Tunicamycin)可以完全阻断BACE1成熟型和非成熟型蛋白的生成,使之转化成非糖基化的蛋白形态,提示成熟型和非成熟型BACE1蛋白均含有N端糖基化修饰。但是,使用小干扰RNA(Si-RNA)干扰RCAN1的表达之后,我们没有发现BACE1的表达有明显下降。N端糖基化修饰发生于在内质网和高尔基体中。我们使用了两种不同的糖苷酶——糖苷内切酶H(endo-glycosidaseH,EndoH)和肽N端糖苷内切酶F(Peptide-N-Glycosidase-F,PNGaseF)来检测RCAN1对BACE1N端糖基化影响的定位。EndoH可以水解在内质网内加上的高甘露糖链和部分N端杂糖链,而PNGaseF可以水解几乎所有的复杂N端糖链。经糖苷酶处理后,PNGaseF将BACE1完全酶切成非糖基化形态,而EndoH则仅将非成熟的BACE1酶切成低糖基化形态,同时RCAN1对成熟型BACE1的上调作用消失,提示RCAN1对BACE1的调控作用主要发生在内质网中。为了进一步验证上述结果,我们使用蔗糖密度梯度离心法分离了细胞质中的内质网和高尔基体,非成熟型的BACE1仪存在于内质网中,且RCAN1的上调作用仍然十分显著。这些结果提示RCAN1主要影响了BACE1内质网中的N端糖基化。第二部分RCAN1对蛋白糖基化的调控作用具有非特异性为了探讨RCANl对BACE1糖基化的影响是否具有特异性,我们引入了另外两种N端糖基化蛋白——BACE2和NCT。其中,BACE2是BACE1的同源异构体,NCT是丫分泌酶亚基之一,二者均影响Ap的生成。WesternBlot显示RCAN1上调了BACE2和NCT的蛋白水平,衣霉素同样可以使BACE2和NCT转化成非糖基化形态。PNGaseF处理可以使BACE2转化成非糖基化形态,而EndoH可以将BACE2酶切成低糖基化形态,提示BACE2和BACE1一样具有复杂的N端糖基化修饰。而PNGaseF和EndoH均能将NCT水解成非糖基化形态,提示NCT的糖基化修饰完全存在于内质网中。使用蔗糖密度梯度离心法检测发现,RCAN1对BACE2和NCT蛋白的上调作用主要存在于内质网中。以上结果提示RCAN1对蛋白糖基化的调控具有非特异性。第三部分RCAN1上调β分泌酶和γ分泌酶的活性进而增加β淀粉样蛋白的生成为了研究RCAN1对BACE1和NCT的糖基化调控是否影响了β分泌酶和Y分泌酶的活性,我们用pBACE1-mycHis和pAPP-myc和质粒共同转染HEK293细胞,发现RCAN1可以显著增加p分泌酶酶切产物C99的表达,这种上调作用在使用Si-NCT抑制丫分泌酶活性的情况下依然存在,提示RCAN1增强了BACE1的酶切活性。Norch蛋白是γ分泌酶的主要作用底物之一,为了验证RCAN1是否对γ分泌酶活性产生影响,我们构建了对Norch信号通路有指示作用的HES-1质粒。对HES-1的启动子活性检测发现,RCAN1对γ分泌酶的活性有显著的上调作用。为了进一步检测RCAN1对p分泌酶和γ分泌酶的影响是否促进了下游酶切产物Ap的生成,我们使用8Mureatricinegel来分离并检测细胞培养基中的Ap含量。研究发现,RCAN1明显上调了Aβ40和Aβ42的蛋白水平。同样,使用ELISA法也证实RCAN1可以促使Aβ40的表达增加。以上结果说明RCAN1通过上调p分泌酶和丫分泌酶的活性增加了Ap的生成。第四部分RCAN1可以与OST的亚基RPNI直接作用从而上调OST的酶活性为了进一步验证RCAN1同样可以影响其他糖基化蛋白的糖基化修饰,我们使用了Pro-QEmerald糖蛋白检测法和刀豆蛋白A来显示全细胞糖蛋白。Pro-QEmerald检测发现转染RCAN1的细胞中糖蛋白的信号明显增强,而刀豆蛋白AWesternBlot显示糖蛋白的表达增加主要存在于内质网而非高尔基体中,进一步验证了RCAN1对糖蛋白的调控作用是非特异的。我们进而合成了具有N端糖基化位点的多肽GNSTVT,采用洋地黄毛苷(Digitonin)半通透法将其转入Hela细胞内。我们发现RCAN1明显上调了多肽的糖基化形态,进一步提示了RCAN1对糖基化蛋白的影响是普遍存在的。N端糖基化是一种复杂的翻译后修饰过程,其在内质网中的核心步骤由OST催化完成。我们构建了OST的亚基质粒STT3A,RPNI,RPNⅡ和OSTC,与RCAN1共转染发现,尽管OST核心组分的STT3A的表达没有明显变化,RPNI,RPNII和OSTC的表达都有上升。有趣的是,阻断RCAN1的表达也观察到了RPNⅠ,RPNⅡ和OSTC这三个OST亚基的表达下降。最近的研究发现,OST单一亚基的下调可以影响其他亚基的功能,从而导致整个OST的活性下降。同时我们发现,上调任何一个OST亚基的表达均能对增加BACE1成熟和非成熟形态的表达,以非成熟形态更为显著,类似于上调RCAN1的作用效果。因此,RCAN1可能影响了OST的稳定性进而对N端糖基化修饰产生影响。为了证实RCAN1是否与OST有直接关联,我们使用了co-IP方法来检测RCAN1和OST亚基的相互作用。结果发现仅有RPNIco-IP检测到了RCAN1的蛋白条带。RPNI可以调控底物递呈给OST核心组分的过程,一些分泌蛋白,如转铁蛋白(Transferrin)勺糖基化修饰不受RPNI调控。WesternBlot检测显示,仅OST的核心组分STT3A的上调促进了Transferrin的表达,RPNⅠ,RPNⅡ和OSTC都未对Transferrin的表达产生影响。同样,上调RCAN1没有检测至Transferring勺表达变化。因此我们推测RCAN1对OST的调控主要是通过不RPNⅠ的相互作用来实现的。综上所述1、本研究证实了RCAN1对OST有调控作用,这种调控作用是通过和OST亚基RPNI的直接作用,增强了OST的稳定性和活性来实现的。OST由多个亚基组成,其核心成分为STT3A,我们的研究发现RCAN1对STT3A的作用不显著,提示RCAN1可能是OST的非核心组分。2、通过对OST的调控作用,RCAN1的过表达可以增强一系列蛋白的糖基化修饰过程,包括BACE1,BACE2和NCT。同样RCAN1可以影响具有N端糖基化位点多肽GNSTVT勺成熟形态表达,但对仅受OST核心组分STT3A调控的分泌蛋白Transferrin的作用效果不大。3、RCAN1通过上调p分泌酶和γ分泌酶糖基化修饰,使其成熟度和酶切活性增高,增加了Ap的生成,导致DS患者出现类似于AD的痴呆和认知功能障碍等症状。这为阐明AD患者中RCAN1高表达的分子病理机制提供了一条新思路。
【作者】王潭；
【导师】孙秀莲；
【作者基本信息】山东大学，神经病学，2014，博士
【关键词】钙调磷酸酶调节因子1；N端糖基化；寡糖转移酶复合体；β淀粉样蛋白；

【参考文献】
[1]吕春阳.面向数据流的Top-k频繁闭项集挖掘算法研究[D].哈尔滨工程大学,计算机应用技术,2012,硕士.
[2]张振兴.Web服务安全性的研究与实现[D].华北电力大学（河北）,计算机应用技术,2004,硕士.
[3]荆璐.论康德的鉴赏判断如何帮助阿伦特解决其政治判断的难题[D].复旦大学,伦理学,2012,硕士.
[4]赵宁.美国国会对华贸易政策及其对中美关系的影响[D].外交学院,国际关系,2004,硕士.
[5]肖沛榕.市场导向、营销创新对企业绩效的影响研究[D].广东财经大学,企业管理,2014,硕士.
[6]张永清.单位经济犯罪问题研究[D].江西财经大学,经济法,2004,硕士.
[7]杨丽洁.复合磁性材料的磁路定理及位移变磁导型电磁感应[D].南京师范大学,物理电子学,2012,硕士.
[8]王婧旖.从动员式政治参与到主动式政治参与的嬗变[D].浙江大学,思想政治教育,2013,硕士.
[9]左樱.UML序列图与状态图的机械语义的研究[D].华东师范大学,计算机软件与理论,2013,硕士.
[10]颜文俊,孙优贤.部分能观的DES监控器设计[J].自动化学报,1995,06:730-733.
[11]崔言君.德彪西艺术歌曲和声技法研究[D].天津音乐学院,作曲与作曲技术理论,2013,硕士.
[12]邹兰军.Liénard方程和非共振Duffing方程研究[D].南京气象学院,应用数学,2004,硕士.
[13]陈英汉.子宫内膜异位症患者腹腔液中细胞因子RANTES的测定[D].中国医科大学,妇产科学,2004,硕士.
[14]王烁婷.农村自杀遗族的心理需求状况及专业心理帮助需求的相关影响因素研究[D].大连医科大学,应用心理学,2012,硕士.
[15]廖洋洋.论我国环境犯罪的立法完善[D].安徽大学,法律,2014,硕士.
[16]王超.海河流域地下水资源管理问题及对策研究[D].天津大学,公共管理,2013,硕士.
[17]徐玉冰.从DA471QLR型发动机升级优化浅析发动机性能优化方法[D].吉林大学,动力工程,2012,硕士.
[18]陈佳璇.我国新闻语言中字母词的易读性研究[D].华东师范大学,汉语言文字学,2003,硕士.
[19]田静.影子银行对中小企业融资影响研究[D].首都经济贸易大学,金融学,2014,硕士.
[20]刘安安.开放式中文实体关系抽取研究[D].哈尔滨工业大学,计算机技术,2013,硕士.
[21]高远,朱孔山,郝加琛,徐连升.山东蒙山6种造林树种40余年成林效果评价[J].植物生态学报,2013,08:728-738.
[22]王英.Aβ_（1-40）诱导海马神经元死亡方式的研究及NGF的抗凋亡作用[D].第四军医大学,神经病学,2003,硕士.
[23]李璐一.基于Kinect的物体分割与识别算法研究[D].重庆大学,仪器科学与技术,2014,硕士.
[24]易格.双曲面麻花钻的刃磨参数及螺旋沟槽结构参数节能优化[D].华中科技大学,机械制造及其自动化,2013,硕士.
[25]何小勤.长江口崇明东滩现代地貌过程研究[D].华东师范大学,自然地理,2004,硕士.
[26]刘婉珍.实名信访举报制度研究[D].华南理工大学,公共管理（专业学位）,2012,硕士.
[27]孙毅.济宁医学院不同体育选项课对大学生体质的影响研究[D].山东体育学院,体育教育训练学,2012,硕士.
[28]谢维成,吕先竞,宋玉忠.基于HTML或MXL描述的Web页信息抽取技术研究[J].情报科学,2005,09:1398-1402.
[29]鞠芳菲.溅射物轨道演化分析及其碎片环境建模研究[D].哈尔滨工业大学,飞行器设计,2014,硕士.
[30]王晨炜.基于B/S模式的产品配置系统的研究[D].河北工业大学,机械工程,2013,硕士.
[31]韦亮.生物造粒流化床分散式污水处理技术的中试试验研究[D].西安建筑科技大学,市政工程,2013,硕士.
[32]肖亚雯.半夏杂交育种初步研究[D].南京农业大学,中药学,2009,硕士.
[33]徐晓健.金刚烷基Gemini表面活性剂的合成和性能研究[D].广东工业大学,化学工程,2014,硕士.
[34]孙晶晶.虚拟数据在人工湿地模型建立过程中的理论方法与应用研究[D].青岛理工大学,市政工程,2012,硕士.
[35]徐奕昊.3D打印技术辅助精细化构建组织工程鼻翼软骨的研究[D].北京协和医学院,整形外科学,2014,博士.
[36]靳祺.GDF-15、MIF、F1+2在冠心病患者中的表达及PCI干预对其影响和临床意义[D].遵义医学院,内科学（专业学位）,2013,硕士.
[37]肖慧.M剖面光纤及其激光器的理论设计研究[D].华中科技大学,光学工程,2013,硕士.
[38]刘丽娟.大学和社区的协同发展研究[D].西南交通大学,行政管理,2013,硕士.
[39]周欣,韩生廉.离散型模糊数及其在预测与决策问题中的应用[J].控制与决策,2000,05:577-580.
[40]何艳辉.H.264视频编码并行算法的研究及其实现[D].湘潭大学,计算机软件与理论,2003,硕士.
[41]李杰,李玲,江大好,张群峰,李小年.α,β-不饱和醛/酮中C＝C双键选择性加氢催化剂的研究进展[J].工业催化,2012,08:13-19.
[42]白雪.塔克拉玛干沙漠西缘沙尘天气过程中空气微生物群落多样性[D].新疆大学,生物学,2013,硕士.
[43]曾澍湘.基于大规模定制的质量管理研究[D].武汉理工大学,管理科学与工程,2003,硕士.
[44]尹德琪.幼儿园男教师流失问题个案研究[D].西南大学,教育学原理,2013,硕士.
[45]李小波.小型猪复合麻醉剂及赛拉嗪对大鼠不同脑区c-fos和c-jun基因表达的影响[D].东北农业大学,临床兽医学,2013,硕士.
[46]陈白璐.基于宽频带记录信号的神经元锋电位检测分类新方法及其应用[D].浙江大学,生物医学工程,2014,硕士.
[47]黄红东.粉尘螨对过敏性哮喘患者气道CD_4～+CD_25～+T细胞的募集作用[D].广西医科大学,呼吸内科,2004,硕士.
[48]孙伟利.基于车载LiDAR技术的公路三维建模与应用[D].首都师范大学,地图学与地理信息系统,2013,硕士.
[49]邓英.汉语“是”字句英译研究[D].湖南师范大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[50]李智辉.碳纳米管/铁—钴/聚苯胺复合对电极材料的制备和表征[D].太原理工大学,2012.