低剂量X线照射对成骨细胞形态及细胞骨架的研究

【摘要】X射线属于电离辐射的一种，在医学中有着广泛的应用，骨科疾病患者常常需要接受多次X射线的照射，而辐照的剂量属低剂量范围以内。低剂量X线辐照离体成骨母细胞，发现可以促进成骨细胞增殖、分化过程，从而加速骨折愈合，但其具体机制尚不清楚。我们的前期研究使用基因芯片技术发现低剂量X线照射会促进与细胞骨架相关基因的表达，可能通过细胞外基质-局部粘附-细胞骨架途径参与低剂量X线照射促进成骨细胞增殖、分化过程。目前，有关低剂量X线照射对成骨细胞骨架的研究还比较少。低剂量X线照射成骨细胞后，肌动蛋白细胞骨架的变化情况及机制尚不明了。本研究采用医用直线加速器对成骨细胞进行0Gy(对照组)、0.5Gy（低剂量组）、5Gy（高剂量组）X线照射，观察成骨细胞在X线照射后细胞内微结构及纤维肌动蛋白的变化，通过Real-TimePCR及Westternblot技术检测胞内RhoA/ROCK、cofilin及其磷酸化水平变化，探讨低剂量X线照射参与成骨前体细胞骨架重构的机制，以及细胞骨架重构对成骨细胞增殖分化的影响，为进一步认识低剂量电离辐射的生物学效应提供理论依据。本实验分为三部分：实验一：不同剂量X线照射对成骨细胞形态及肌动蛋白细胞骨架重构的影响目的：观察不同剂量X线照射作用于成骨细胞后，细胞形态、胞内微结构及纤维肌动蛋白的变化情况，为进一步研究低剂量X线照射引起成骨细胞肌动蛋白骨架重构的机制提供实验基础。方法：从中国科学院细胞库购得MC3T3-E1细胞，采用医用直线加速器以0Gy、0.5Gy、5Gy（剂量率为200cGy／min）作用成骨细胞后，用倒置相差显微镜观察细胞形态的变化，透射电镜观察细胞内微结构变化以及FITC-phalloidin对各实验组细胞的F-actin进行染色，荧光显微镜下观察各实验组肌动蛋白细胞骨架的变化。结果：0.5Gy、5Gy组细胞的F-actin在照射后2h后遭到破坏，且随着辐射剂量的增加破坏程度越严重，呈剂量依赖性。但24h后细胞肌动蛋白骨架发生重构，F-actin染色逐渐增强、纤维增粗，照射后第3天时最为显著，但至第5天时F-actin染色逐渐恢复正常，与0Gy组接近。结论：X线辐射短时间内能使成骨前体细胞骨架破坏、F-actin解聚，但随后细胞肌动蛋白骨架发生重构，F-actin表达增强，至第5d时逐渐恢复正常。实验二：RhoA/ROCK信号通路在介导低剂量X线照射引起成骨细胞肌动蛋白细胞骨架重构中的研究目的：研究RhoA/ROCK信号通路在低剂量X线照射引起肌动蛋白细胞骨架重构中的作用。方法：采用医用直线加速器以0Gy、0.5Gy、5Gy作用成骨细胞后，以Real-TimePCR及Westternblot技术检测细胞内RhoA、ROCK、cofilin及磷酸化cofilin（phospho-cofilin）水平变化。随后以ROCK激酶特异性抑制剂Y27632预处理成骨细胞，观察X线照射后细胞肌动蛋白骨架变化情况。结果：成骨细胞经0.5、5GyX线照射后1天，各实验组RhoA、ROCK、phospho-cofilin含量开始升高，第3天变化最为明显，直至5天后各实验组RhoA、ROCK、phospho-cofilin含量趋于下降。Y27632预处理组细胞肌动蛋白骨架遭到破坏，肌动蛋白纤维排列稀疏紊乱，阻断了低剂量X线照射引起的细胞骨架重构。结论：低剂量X线照射可以通过RhoA/ROCK信号通路引起成骨细胞肌动蛋白骨架重构。实验三：抑制细胞骨架重构对低剂量X线作用下成骨细胞增殖分化的影响目的：研究RhoA/ROCK信号通路在低剂量X线照射促进成骨细胞增殖分化过程中的作用。方法：在对成骨细胞进行低剂量X线照射前，使用ROCK激酶特异性抑制剂Y-27632预处理细胞，随后以CCK-8、ALP活性检测、茜素红钙结节染色、Westernblot技术检测经0.5GyX线照射后成骨细胞的增殖、分化情况。结果：使用ROCK激酶抑制剂Y27632处理细胞后可以阻断低剂量X线照射促成骨细胞增殖、分化作用。+Y276320.5Gy组细胞各项成骨分化指标降低，与0Gy组相比无明显差异。结论：RhoA/ROCK信号通路参与低剂量X线照射促进成骨细胞增殖、分化的作用。
【作者】黄群；
【导师】董启榕；
【作者基本信息】苏州大学，骨外科学，2014，硕士
【关键词】成骨细胞；X线照射；肌动蛋白细胞骨架；RhoA/ROCK；细胞形态；细胞骨架；低剂量照射；增殖分化；

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