在无关allo-HSCT中KIR2DL1高分辨等位基因分布及其表达差异对移植预后的影响

【摘要】
【作者】王苗；
【导师】何军；
【作者基本信息】苏州大学，血液病学，2014，硕士
【目的】通过建立KIR2DL1高分辨等位基因全长测序的实验方法，研究中国汉族人群中KIR2DL1高分辨等位基因的分布频率及与其配体的相关性，探讨其在无关异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)遴选供体中的作用；通过流式细胞术(FCM)检测初治恶性血液病、移植前供者及移植后患者体内供者来源的NK细胞表面KIR2DL1的表达差异，研究其对allo-HSCT预后的影响。
【方法】通过基因测序(Sequence-basedtesting，SBT)与特异性引物聚合酶链反应(Sequencespecificprimers,PCR-SSP)的方法对244名中国汉族无关供患者的外周血标本进行KIR基因分型、KIR2DL1高分辨等位基因分型和HLA高分辨基因分型检测，分析KIR2DL1高分辨等位基因在中国汉族人群中的分布特点及与其配体HLA-C的相关性。通过流式细胞术对2011年3月到2013年9月之间89名无关志愿者的外周血干细胞标本进行KIR2DL1膜蛋白水平的检测，并对其中48例进行KIR2DL1高分辨等位基因分型检测，探讨KIR2DL1高分辨等位基因型与表型的相关性；通过46例临床病例分析KIR2DL1高分辨等位基因型与造血干细胞移植预后的相关性；动态检测113例患者移植后1M、2M、3M不同时间点NK细胞及KIR2DL1的表达变化，结合移植后临床资料分析KIR2DL1的表达对移植预后的影响。
【结果】1.中国汉族人群中KIR2DL1等位基因的分布特点及与其他人种的差异性1)227名个体(454个等位基因)有3名(1.32%)不表达KIR2DL1基因，全长测序在表达KIR2DL1基因的224名个体中发现3种等位基因，即KIR2DL1*00302、KIR2DL1*00201和KIR2DL1*00401；表型分布频率分别为83.70%(380/454)、11.89%(54/454)和3.08%(14/454)。本研究结果显示中国汉族人与日本人种的KIR2DL1等位基因表型分布相似，差异无统计学意义(P>0.05)，与北爱尔兰人和印第安人明显不同，差异均有统计学意义(P<0.05)。2)对KIR2DL1高分辨等位基因与KIR其他功能基因的连锁分析发现表达率较高KIR2DL1*00302和KIR2DL1*00201均与KIR2DS1、KIR2DS4、KIR2DL3、KIR3DL1/S1存在连锁关系，并均具有统计学意义(P＜0.001)。2.研究KIR2DL1高分辨等位基因型与HLA-C配体识别及表达的相关性1)224名个体(448个等位基因)的KIR2DL1高分辨结果与HLA-C位点相关性分析显示：KIR2DL1*00302与HLA-C2和HLA-C*06:02有相关性(P＜0.001)，而与HLA-C1无相关性(P＞0.001)；KIR2DL1*00201和KIR2DL1*00401与HLA-C1和HLA-C2均无相关性(P＞0.001)。2)对其中75名供者为KIR2DL1*00302/00302纯合子与相应患者HLA-C位点分析发现KIR2DL1*00302与HLA-C*01:02组合是产生异源反应活性最常见的受配体组合，与HLA-C*06:02是最常见的识别受配体组合。3)KIR2DL1*00302、KIR2DL1*00201和KIR2DL1*00401等位基因型的膜表达水平间无明显差异性(P>0.05)。但通过对KIR2DL1膜表达水平与相应HLA-C配体的研究发现，存在HLA-C1/C2和C2/C2配体组的KIR2DL1表达水平高于C1/C1配体组，且差异有统计学意义(P<0.05)。3.KIR2DL1膜蛋白表达水平与无关allo-HSCT预后的相关性1)通过随访46例接受无关HLA全相合allo-HSCT恶性血液病患者的临床资料，并未发现KIR2DL1高分辨等位基因型与临床预后有相关性(P>0.05)。2)通过动态检测113例恶性血液病患者移植后KIR2DL1膜蛋白水平的表达结果表明：初治恶性血液病患者的KIR2DL1表达水平明显低于正常无关供体的表达，且差异具有统计学意义(P<0.05)。免疫耐受组患者(n=59)的NK细胞在移植后1M表达水平最高，后逐渐下降，至移植后3M时患者体内NK细胞水平仍高于供体水平，且有统计学差异(P<0.05)；KIR2DL1受体基因在移植后1M时表达水平最低，随时间推移逐渐升高，至3M时重建为供者水平(P>0.05)。早期复发患者(n=8)的KIR2DL1的表达水平明显低于同期免疫耐受组，差异有统计学意义(P<0.05)，而与移植前患者的表达未见明显差异性(P>0.05)。④aGVHD组(n=38)的KIR2DL1表达水平均高于同期免疫耐受组，但未见明显统计学意义(P>0.05)。
【结论】KIR2DL1高分辨等位基因在中国汉族人群中呈明显偏态分布，KIR2DL1*00302是最常见的等位基因。KIR2DL1高分辨等位基因与其配体HLA-C2存在连锁关系，且KIR2DL1*00302与HLA-C*01:02组合是产生异源反应活性最常见的受配体组合，与HLA-C*06:02是最常见的识别受配体组合。识别自身HLA-C2配体的供体较不识别自身配体的供体的KIR2DL1表达水平高。不同KIR2DL1高分辨等位基因型间的表达水平无差异性，KIR2DL1高分辨等位基因型对无关造血干细胞移植预后无明显影响。移植后动态检测KIR2DL1的膜蛋白表达的变化，能预测患者移植后的复发。移植后NK细胞与其受体KIR2DL1基因免疫重建的时间存在明显差异性，因此，移植后动态监测KIR2DL1的表达比研究NK细胞的表达水平更能反映NK细胞杀伤白血病细胞的作用（GVL效应）。
【关键词】造血干细胞移植；非血缘；KIR2DL1；高分辨等位基因；复发；

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