mTOR信号转导途径在再生障碍性贫血T淋巴细胞中的改变及影响因素

【摘要】目的：（1）.探讨mTOR信号通路在再生障碍性贫血T淋巴细胞中是否激活以及雷帕霉素（RAPA）和CTLA-4免疫球蛋白（CTLA-4Ig）对该信号通路转导途径中各分子及上、下游负性调控因子表达水平的影响。（2）.丰富AA中T淋巴细胞活化机制，探讨RAPA及CTLA-4免疫球蛋白对再障T淋巴细胞mTOR通路的调控作用，寻找AA免疫抑制治疗（IST）的新靶点。方法：（1）.流式细胞术（FCM）检测37例AA患者外周血CD3+T淋巴细胞中磷酸化Akt（p-Akt）、磷酸化mTOR（p-mTOR）、磷酸化TSC（p-TSC）、磷酸化P70S6K（p-P70S6K）、磷酸化S6（p-S6）、磷酸化4EBP1（p-4EBP1）、Sirt1表达水平。同时以17例体检者外周血为正常对照组、急性T淋巴细胞白血病细胞株（CEM）作为阳性对照组。（2）.取患者外周血及CEM进行体外培养，分别加入RAPA和CTLA-4Ig孵育24小时和72小时，再用FCM检测CD3+T淋巴细胞中p-Akt、p-mTOR、p-TSC、P70S6K、p-S6、p-4EBP1、Sirt1表达水平。以CEM作为阳性对照组，根据RAPA和CTLA-4Ig作用前后上述因子表达水平的变化，评价这两种药物对AA患者mTOR途径及其上下游负性调控因子的影响。（3）.实时定量PCR法测定30例AA患者GAS5的表达，与20例志愿者为正常对照、急性T淋巴细胞白血病细胞株（CEM）阳性对照相比较。（4）.取30例AA患者骨髓及CEM进行体外培养，分别加入RAPA和CTLA-4Ig孵育24小时和72小时后，实时定量PCR法测定AA患者及CEM的GAS5表达。以CEM为阳性对照，评价这两种药物对AA患者mTOR途径负性调控因子GAS5的影响。（5）.比较AA组与正常对照组、CEM组RAPA、CTLA4-Ig作用前后p-Akt、p-mTOR、p-TSC、P70S6K、p-S6、p-4EBP1、Sirt1的表达量变化，讨论AA患者T淋巴细胞mTOR信号通路是否激活、药物对其的调控作用，以及各组间Sirt1/p-Akt、Sirt1/p-TSC、Sirt1/p-mTOR、Sirt1/p-4EBP1、Sirt1/p-P70S6K及Sirt1/p-S6之间的差异。结果：（1）AA组CD3+T淋巴细胞中，mTOR途径各磷酸化分子：p-Akt、p-TSC、p-mTOR、p-P70S6K、p-S6、p-4EBP1的表达水平分别为：(1.86±1.51)、(2.21±0.21)、(1.64±1.28)、(1.44±0.31)、(1.63±1.04)、(8.11±3.89)；正常对照组中为：(1.11±0.35)、(1.60±0.86)、(1.11±0.35)、(1.12±0.59)、(1.01±0.23)、(1.32±0.87)；与正常对照组相比，AA组mTOR途径中各磷酸化分子表达水平显著升高，P均<0.05；mTOR途径负性调节因子：Sirt1、GAS5的表达水平分别为：(0.98±0.07)、(2.83±1.52)明显低于正常对照组(1.68±0.32)、(12.43±4.50)，P均<0.05。（2）RAPA孵育后AA组CD3+T淋巴细胞中：mTOR途径各磷酸化分子：p-Akt、p-TSC、p-mTOR、p-P70S6K、p-S6、p-4EBP1的表达水平分别为：(1.07±0.16)、(1.75±0.59)、(0.95±0.31)、(1.10±0.27)、(1.00±0.13)、(5.10±3.44)，均较孵育显著下降，P均<0.05。RAPA孵育后AA组mTOR途径负性调节因子：Sirt1、GAS5的表达水平分别为：(1.48±0.81)、(4.12±2.11)，与孵育前相比，RAPA孵育后AA组中GAS5的表达水平明显升高，P<0.05；两组间Sirt1表达水平无明显差异，P=0.149，但RAPA孵育后AA组中Sirt1/p-Akt、Sirt1/p-TSC、Sirt1/p-mTOR、Sirt1/p-4EBP1、Sirt1/p-P70S6K及Sirt1/p-S6的值显著高于孵育前，P<0.05。（3）CTLA-4Ig孵育后AA组CD3+T淋巴细胞中：mTOR途径各磷酸化分子：p-Akt、p-TSC、p-mTOR、p-P70S6K、p-S6、p-4EBP1的表达水平分别为：(1.01±0.36)、(1.59±0.72)、(0.80±0.44)、(1.01±0.31)、(0.99±0.41)、(3.91±2.86)；与孵育前相比，RAPA孵育后AA组mTOR途径中各磷酸化分子表达水平显著下降，P均<0.05。CTLA-4Ig孵育后AA组mTOR途径负性调节因子：Sirt1、GAS5的表达水平分别为：(1.31±0.50)、(4.45±0.52)；正常对照组为：(1.68±0.32)、(12.43±4.50)；与孵育前相比，CTLA-4Ig孵育后AA组中Sirt1、GAS5的表达水平明显升高，P<0.05。（4）阳性对照组CEM细胞株中，mTOR途径各磷酸化分子：p-Akt、p-TSC、p-mTOR、p-P70S6K、p-S6、p-4EBP1的表达水平分别为：(3.45±1.23)、(5.61±2.11)、(3.68±1.67)、(3.85±1.41)、(3.67±1.35)、(13.12±5.31)；与AA组相比，CEM组mTOR途径中各磷酸化分子表达水平显著升高，P<0.05；CEM细胞株mTOR途径负性调节因子：Sirt1、GAS5的表达水平分别为：(0.98±0.16)、(1.23±0.68)低于AA组及正常对照组，P均<0.05；RAPA孵育后CEM细胞株，mTOR途径各磷酸化分子：p-Akt、p-TSC、p-mTOR、p-P70S6K、p-S6、p-4EBP1的表达水平分别为：(1.02±0.26)、(4.21±1.36)、(1.98±0.41)、(2.85±1.12)、(1.89±1.11)、(3.3±1.51)，较孵育前显著下降，P<0.05，RAPA孵育CEM细胞株组mTOR途径负性调节因子：Sirt1、GAS5的表达水平分别为：(1.14±0.23)、(2.33±0.78),高于孵育前，P<0.05；CTLA-4Ig孵育后CEM细胞株，mTOR途径各磷酸化分子：p-Akt、p-TSC、p-mTOR、p-P70S6K、p-S6、p-4EBP1的表达水平分别为：(0.99±0.32)、(4.63±2.31)、(1.86±0.23)、(2.67±1.34)、(2.36±1.45)、(2.48±1.32)均显著低于孵育前，P<0.05，RAPA孵育CEM细胞株组mTOR途径负性调节因子：Sirt1、GAS5的表达水平分别为：(2.11±0.36)、(2.11±1.01)高于孵育前，P<0.05。结论：（1）AA组CD3+T淋巴细胞mTOR途径各磷酸化蛋白表达水平均明显增高，上游负性调节因子Sirt1及下游GAS5表达不足，提示AA组中mTOR途径处于相对活化状态可能参与AA组T淋巴细胞的活化，且其活化状态与负调控因素不足有关。（2）RAPA及CTLA4-Ig可抑制AA患者T淋巴细胞mTOR信号通路中各关键磷酸化分子的表达，且相对或绝对上调负性调控因子Sirt1及GAS5水平。
【作者】吴倩；
【导师】何广胜；陈苏宁；
【作者基本信息】苏州大学，血液病学，2014，硕士
【关键词】再生障碍性贫血；T淋巴细胞；mTOR信号通路；磷酸化蛋白；免疫；负性调节因子；雷帕霉素；CTLA-4免疫球蛋白；

【参考文献】
[1]李宏波.贵州省未成年人犯罪问题分析及预防研究[D].贵州民族大学,刑法学,2013,硕士.
[2]李菊芳.建筑结构基于能量的地震反应分析及设计方法[D].西安建筑科技大学,结构工程,2004,硕士.
[3]解飞.我国民间借贷立法规制研究[D].云南财经大学,法律（专业学位）,2013,硕士.
[4]张宇.C型凝集素受体DC-SIGN在特应性皮炎发病中的作用机制研究[D].北京协和医学院,皮肤病与性病学,2014,博士.
[5]张军.对我国企业实施全面预算管理的探讨[D].江西财经大学,会计学,2004,硕士.
[6]串俊兵.爆炸发射石墨阴极的制备与强流电子发射性能的研究[D].国防科学技术大学,材料科学与工程,2012,硕士.
[7]齐航.社会转型背景下的陕南地区新农村规划研究[D].西安建筑科技大学,建筑与土木工程（专业学位）,2013,硕士.
[8]王文博.外延设备硅片传输控制软件研发[D].郑州大学,机械电子工程,2013,硕士.
[9]杨逾初.城市商业银行电子银行业务发展策略的研究[D].贵州财经大学,金融,2013,硕士.
[10]时阳.歌剧《波吉与贝丝》中贝丝的人物形象塑造及演唱特征分析[D].上海师范大学,音乐学,2013,硕士.
[11]梁玉鑫.滑模变结构控制在两轮自平衡机器人系统中的应用研究[D].哈尔滨理工大学,模式识别与智能系统,2012,硕士.
[12]费敏锐.双级计算机控制和管理系统在热处理炉中的应用[J].冶金自动化,1993,04:45-46.
[13]李稳.淫羊藿苷协同三氧化二砷对人肝细胞肝癌的抑制作用[D].山东大学,内科学（专业学位）,2014,博士.
[14]杜俊毅.大肠合募俞穴治疗功能性便秘协同作用的临床观察[D].湖南中医药大学,针灸推拿学（专业学位）,2014,硕士.
[15]王帮俊.企业信息化建设存在的问题与对策[J].华夏星火,2003,04:65-68.
[16]武玉慧.白血病预后相关因素、移植疗效及移植后复发防治的探讨[D].南方医科大学,血液内科学,2012,硕士.
[17]邹怡.平衡计分卡在我国商业银行绩效考核管理中的应用研究[D].西北大学,金融（专业学位）,2014,硕士.
[18]刘婷婷.对泰汉语结果补语教学研究[D].湖南师范大学,对外汉语,2013,硕士.
[19]甘乐平.革命老区县域经济可持续发展研究[D].江西农业大学,农村与区域发展,2011,硕士.
[20]李常磊.曳引电梯能效评价方法研究[D].长安大学,交通信息工程及控制,2014,硕士.
[21]许云.通用地球物理公司(CGG)程序[J].石油地球物理勘探,1973,S1:22-64+71.
[22]华林.信用违约互换的定价与模型[D].山东大学,概率论与数理统计,2013,硕士.
[23]马人月.职场真人秀节目研究[D].黑龙江大学,新闻与传播,2013,硕士.
[24]田佳.液—液界面双亲性金纳米粒子的制备及在溶液中的自组装[D].南开大学,2012.
[25]徐建华.摩擦学实验装置研制与试验研究[D].机械科学研究总院,机械设计及理论,2013,硕士.
[26]杨巍.微丝电极阵列制备及其输入输出特性研究[D].郑州大学,检测技术与自动化装置,2013,硕士.
[27]张恒.微细电极电火花磨削装置及运丝系统稳定性研究[D].哈尔滨工业大学,机械工程,2013,硕士.
[28]刘栋.沿海水产加工企业信贷风险控制研究[D].新疆大学,工商管理,2013,硕士.
[29]戴海容,王丽萍.网络环境下个体行为向群体行为演化路径分析[J].商业时代,2013,34:18-19.
[30]许白羽.自保守混凝动力学方程的数值求解与分析[D].北京交通大学,环境工程,2013,硕士.
[31]董洪楠.白假丝酵母菌生物膜中滞留菌形成的动态监测及其相关基因的初步筛选[D].山东大学,口腔临床医学,2013,硕士.
[32]王宏琳.物探软件技术进步与《石油地球物理勘探》[J].石油地球物理勘探,2005,02:136-137.
[33]卞春雨.数控机床旋转轴几何误差的补偿系统研究[D].哈尔滨工业大学,控制科学与工程,2013,硕士.
[34]李永芳.基金会资产运营与资金增值研究[D].浙江大学,法律（专业学位）,2012,硕士.
[35]冯剑波.路易斯酸催化酯化方法及绿色氧化在合成酰胺化合物中的应用[D].浙江理工大学,应用化学,2014,硕士.
[36]金皖豫,李铭,何杨辉,杜正刚,邵钧炯,张国栋,周灵燕,周旭辉.不同施氮水平对冬小麦生长期土壤呼吸的影响[J].植物生态学报,2015,03:249-257.
[37]李欣.成骨细胞应力学效应中Notch信号及其关键因子APH1作用机制的研究[D].山东大学,口腔临床医学（专业学位）,2013,硕士.
[38]林伟超.广州铁通宽带网络与OTN+PTN组网技术研究[D].华南理工大学,电子与通信工程,2014,硕士.
[39]何一群.活性碳纤维SBBR对畜禽养殖废水脱氮除磷研究[D].北京化工大学,环境科学与工程,2013,硕士.
[40]郑海军.重组人白介素-29在毕赤酵母中的表达及抗肿瘤活性分析[D].江南大学,生物化学与分子生物学,2013,硕士.
[41]吕玉卿,刘慧贞.化学阶段性创新测试题(1)[J].中学生数理化(初中版)(中考版),2012,10:41-43.
[42]朱亮.10kV配电网小电阻接地系统单相短路故障及其保护研究[D].湖南大学,电气工程,2011,硕士.
[43]沈阳.中小企业雇主吸引力影响因素研究[D].扬州大学,企业管理,2011,硕士.
[44]贺挨扬.HL—30型液压钻机在施工中的应用[J].山西科技.2002(02)
[45]康文越.地佐辛预处理对开胸患者术后镇痛的影响[D].吉林大学,临床医学,2014,硕士.
[46]张义霞.钯催化无外加配体的纯水相Suzuki反应[D].大连理工大学,应用化学,2013,硕士.
[47]单立灿.金星激波及其前兆激波中的超低频波动[D].中国科学技术大学,空间物理,2014,博士.
[48]张佳旗.脉冲激光沉积制备氧化物薄膜及其光电性质的研究[D].吉林大学,无机化学,2013,硕士.
[49]季翔.p-HDL的AE-HPLC方法检测及其在镰状细胞病中形成机制的相关研究[D].山东大学,老年医学,2014,博士.
[50]陈祝林.三维CAD开发结构系列化设计[J].自动化学报,1993,02:245-247.