人脐血内皮祖细胞糖基化修饰及其在骨折修复中的作用及机制研究

【摘要】第一部分人脐血内皮祖细胞糖基化修饰在缺血修复中的应用目的：血管内皮祖细胞（endothelialprogenitorcells,EPCs）用于缺血性疾病治疗最关键的是干细胞必须定向归巢到缺血坏死组织，而细胞归巢的第一步就是EPCs表达的P-选择素糖蛋白配体（P-selectinglycoprotein,PSGL-1）与P-选择素、E-选择素的结合完成的。天然的EPCs的PSGL-1末端缺乏岩藻糖化的O-糖结构（sialylLewisx,sLex）。我们通过体外质粒转染进行糖基化修饰，探讨EPCs糖基化修饰后对其定向归巢到缺血组织能力的影响，以及对其生成血管能力的影响，为进一步应用于临床治疗提供依据。方法：（1）收集健康产妇脐血，采用密度梯度离心法分离单核细胞层，CD34免疫磁珠法获取原代EPCs，使用纤维连接蛋白处理的培养板、内皮特异性培养液，形成内皮细胞克隆进行传代。（2）利用流式细胞仪、免疫荧光分析EPCs表面标记分子的表达，检测细胞摄取DiI-AcLDL的能力及体外成血管能力。（3）通过蛋白印迹实验（Westernblot）鉴定EPCs体外糖基化修饰，流式细胞仪检测sLex的表达，EPCs与P-选择素、E-选择素的结合能力。（4）通过肿瘤坏死因子α刺激脐静脉内皮细胞（HUVEC）模拟体内炎症反应过程，检测EPCs与HUVEC的粘附，评估糖基化修饰对EPCs与HUVEC粘附能力的影响。（5）建立免疫缺陷小鼠下肢缺血模型，尾静脉注射EPCs，通过免疫荧光方法检测糖基化修饰对细胞定向归巢能力的影响，缺血端新生血管的形成情况，并定量分析。（6）利用激光多普勒血流成像仪(LaserDopplerperfusionimaging,LDPI)缺血端血流，评估缺血恢复情况。结果：（1）通过密度梯度离心法和免疫磁珠法筛从脐血中筛选出CD34+细胞，接种于FN包被的培养皿中。接种5天后可见细胞呈“铺路石样”生长。（2）对EPCs进行鉴定：流式细胞术检测显示，CD34、CD133、CD31、CD105、CD144、CD146和VEGFR2的表达均为阳性，CD14及CD45的表达为阴性；免疫荧光染色EPCs细胞表面CD31、CD144、VWF阳性；将EPCs与DiI-AcLDL共孵育，荧光显微镜下观察到EPCs具有摄取DiI-AcLDL的能力；将细胞加至Matrigel基质胶上，培养3h后，可观测到血管网状结构形成，显示EPCs具有成血管能力。（3）用人岩藻糖基转移酶（α1,3-fucosyltransferaseⅥ,FucTVI）构建的质粒转染EPCs，Westernblot检测到重组人岩藻糖基转移酶蛋白的表达。EPCs流式细胞仪检测发现糖基化修饰后FucTVI转染组sLex的表达明显高于空载体质粒转染组；FucTVI转染组EPCs与P-选择素、E-选择素的结合能力也高于空载体对照组；糖基化修饰组EPCs与肿瘤坏死因子α刺激后的HUVEC的结合能力显著提高，约为未糖基化组的2倍（p<0.01）。（4）建立下肢缺血模型，尾静脉注射EPCs，三天后收集缺血侧肌肉组织，荧光显微镜下计数荧光标记的细胞数，经统计糖基化组的EPCs归巢到局部的数目显著高于未糖基化组（p<0.01）。（5）建立下肢缺血模型术后2W时，取缺血端组织冰冻切片，CD31标记血管，共聚焦显微镜下采集图像。EPCs糖基化组与未糖基化组新生毛细血管显著高于生理盐水对照组（p<0.01），同时糖基化修饰的EPC新生血管能力远高于未糖基化组（p<0.01）。（6）建立下肢缺血模型术后2W时，采用LDPI检测缺血侧血流情况，结果显示糖基化处理组较生理盐水组升高90±6%，未糖基化处理组较生理盐水组升高42±3%，三组之间的差异均有统计学意义（p<0.01）。结论：我们成功地从脐血中分离和培养了EPCs，研究发现脐血来源的EPCs存在PSGL-1糖基化缺陷，通过体外糖基化修饰恢复了EPCs的PSGL-1功能后，经体外实验和体内动物模型证实了糖基化修饰后EPCs具有促进EPCs归巢、缺血端血管生成的作用。为脐血来源的EPCs用于缺血性疾病的治疗奠定了理论及实验基础。第二部分人脐血内皮祖细胞糖基化修饰在骨折修复中的作用及机制研究目的：骨折端血运是影响骨折修复的关键因素之一。血供的不足常导致骨延迟愈合或者骨不愈合。近年来，血管内皮祖细胞（EPCs）因其有很强的成血管能力而被用于骨折修复的干细胞治疗。我们前期研究发现EPCs体外糖基化修饰提高了其定向归巢到缺血端组织的能力，增加了局部血管形成，促进局部血流的恢复。本实验通过建立股骨骨折模型，探讨EPCs糖基化修饰在骨折修复中的作用及相关机制研究，为以后在骨折治疗中的应用奠定理论基础。方法：（1）免疫缺陷小鼠随机分为三组：EPCs糖基化修饰组、未糖基化组、生理盐水组，建立闭合型股骨骨折模型，将EPCs及生理盐水行尾静脉注射，定期观察相关指标。（2）通过免疫荧光方法检测糖基化修饰对细胞定向归巢能力的作用。（3）通过RT-PCR技术对归巢到骨折端的EPCs基因表达情况进行分析。（4）利用全组织染色方法，探究EPCs糖基化修饰后对骨折端骨膜血管再生的作用。（5）利用LDPI评估骨折端血流的恢复情况。（6）通过X线摄影及Micro-CT扫描骨痂，分析糖基化修饰对骨痂愈合的影响。（7）对骨痂切片行蕃红O/固绿染色，观察三组间骨痂结构的差异。结果：（1）建立模型后2h，将经DiI-Ac-LDL标记EPCs或生理盐水，通过尾静脉注入体内，一周后收集骨折端组织，经计数统计糖基化组的EPCs归巢到局部的数目明显大于未糖基化组（76±6vs.27±4cells/mm2,p<0.001）。（2）造模一周后取骨折端组织行RT-PCR，结果显示生理盐水组骨折端组织内未见CD31、VE-Cad表达，而未糖基化组及糖基化组骨折端组织内均有CD31、VE-Cad等EPCs相关基因的表达。（3）用PECAM-1标记骨痂表面的骨膜血管，术后2W时EPCs糖基化修饰组骨膜新生血管数显著高于其它两组（p<0.05）4W时EPCs注射与生理盐水组比较有统计学差异（p<0.05），糖基化组与未糖基化组之间没有统计学差异（p>0.05）。（4）LDPI检测骨折端血流，术后当天三组间血流相对百分比没有统计学差异（p>0.05)，术后2W时糖基化修饰组血流灌注显著高于其余两组，三组间比较有统计学差异（p<0.05）。（5）通过X线片计算相对骨痂面积。术后2W时糖基化组与其余两组相比，骨痂面积较大（p<0.05），术后4W时糖基化组明显小于其它两组（p<0.05）。术后6W时生理盐水组与其他两组相比，有统计学差异（p<0.05），术后8W时三组间没有统计学差异（p>0.05）。（6）经Micro-CT扫描，术后2W、4W时糖基化组骨痂TV值显著高于其它两组（p<0.05），术后6W时EPCs两组间TV值相似，但是显著大于生理盐水组（p<0.05），术后8W时三组无统计学差异（p>0.05）。BV/TV值在骨折愈合过程中逐渐升高，糖基化组一直处于最高，同时未糖基化组显著高于生理盐水组（p<0.05）。（7）组织学染色显示，术后2W时生理盐水组含有大量的软骨细胞，糖基化修饰组含有大量的编织骨性组织与少量的软骨细胞，未糖基化组介于两组之间。术后4W时糖基化组含有大量的皮质骨，其余两组均处于初级骨塑形阶段。结论：EPCs糖基化修饰显著提高了其定向归巢到骨折端的能力，促进了局部骨膜血管的形成及血流的恢复，加快骨塑形及最终骨折端的骨密度，改善了骨的质量，在骨折创伤的治疗领域具有广阔的应用前景。
【作者】孙晟轩；
【导师】周海斌；
【作者基本信息】苏州大学，骨外科学，2014，硕士
【关键词】脐血内皮祖细胞；糖基化修饰；归巢；缺血模型；成血管；骨折模型；骨愈合；

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