内源性抗菌肽Cathelicidins在慢性阻塞性肺疾病病理改变中作用的研究

【摘要】研究背景慢性阻塞性肺疾病(Chronicobstructivepulmonarydisease,COPD)是严重危害人类健康的常见病和多发病,因其患病率和死亡率高,造成沉重的社会经济负担,已成为全球重要的公共卫生问题。COPD是一种以气流受限为特征的慢性气道炎症性疾病,小气道重塑和肺气肿是引起气流受限的主要原因,探讨其形成机制,对于有效控制COPD病情进展,具有重要的意义。抗菌肽(antimicrobialpeptides,AMPs)是在动物防御系统中发现的一种多肽,由宿主基因编码,在天然免疫中发挥重要作用。AMPs主要分为两大家族：Cathelicidins家族和防御素家族。hCAP18/LL-37(以下简称LL-37)是人体Cathelicidins家族的唯一成员,既往的研究多集中于其抗菌作用,近年来的研究表明,LL-37在炎症反应、损伤修复、细胞增殖和凋亡等多种病理生理过程中也发挥重要作用。我们的前期研究显示,COPD稳定期患者诱导痰中LL-37的表达较非COPD对照组显著增高,且LL-37的表达与诱导痰中炎症指标IL-8水平呈显著正相关,与患者第一秒用力呼气容积占预计值百分比(FEV1%)呈显著负相关；进一步研究发现,COPD患者肺组织LL-37的表达显著高于非COPD对照组,LL-37主要表达于小气道上皮细胞、肺泡上皮细胞、炎性细胞(中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞)和成纤维细胞中。这些研究结果表明,异常高表达的LL-37可能参与了COPD的病理过程。分析我们的前期研究结果可见,LL-37在COPD吸烟组患者肺组织小气道上皮细胞和肺泡上皮细胞中的表达显著高于吸烟对照组,而不吸烟对照组患者小气道上皮细胞和肺泡上皮细胞中LL-37的表达显著低于前两者。基于上述研究背景,我们提出以下问题：①COPD患者肺组织小气道和肺泡上皮细胞异常高表达的LL-37是否与小气道重塑和肺气肿的病理改变有关?②吸烟是否为诱导肺组织LL-37表达增高的重要因素?③COPD小气道上皮细胞高表达的LL-37怎样影响其周围的胶原沉积和组织重塑?④LL-37在小气道区和肺泡区均高表达,但却出现胶原过度沉积的小气道重塑和极少胶原沉积的肺气肿两种不同的病理改变,其原因是什么?为了回答上述问题,我们进行了本课题的设计和研究。目的探讨内源性抗菌肽Cathelicidins在COPD小气道重塑和肺气肿病理改变中的作用及相关机制。方法1.观察COPD患者肺组织Cathelicidin(LL-37)的表达,分析其与COPD小气道重塑和肺气肿病理改变的关系。(1)研究对象及临床资料收集：选择因肺外周肿瘤行肺叶切除术的患者60例,其中稳定期COPD吸烟患者(COPD吸烟组)18例,肺功能正常的吸烟患者(吸烟对照组)22例,肺功能正常的不吸烟患者(不吸烟对照组)20例。术前收集性别、年龄和吸烟史等一般资料,并行肺功能检查,COPD的诊断按照慢性阻塞性肺疾病全球倡议(GlobalInitiativeforChronicObstructiveLungDisease,GOLD)标准。(2)人体肺组织标本：①HE染色测量小气道壁厚度、平均内衬间隔(meanlinearintercept,MLI)和平均肺泡数(meanalveolarnumber,MAN),天狼猩红染色检测肺组织胶原沉积面积；②免疫组织化学染色法检测肺组织中LL-37的表达；③分析小气道区LL-37的表达与小气道壁厚度、胶原沉积面积的相关性,以及肺泡上皮细胞LL-37的表达与MLI、MAN的相关性。2.烟熏法建立大鼠COPD模型,研究香烟烟气对大鼠肺组织Cathelicidin(rCRAMP)表达的影响,并分析Cathelicidin(rCRAMP)与大鼠小气道重塑和肺气肿病理改变的关系。雄性Wistar大鼠72只,随机分为烟熏组和空白对照组,每组根据造模时间分为1月组、3月组和6月组,每组各12只。烟熏组大鼠每日置于烟气染毒柜中被动吸烟(南方牌香烟,焦油量：14mg,烟气烟碱量：lmg)两次,每次10支香烟持续30mmin,两次间隔时间不低于6小时。空白对照组大鼠不做特殊处理。造模过程中每隔2周对大鼠逐只称重,记录大鼠体重变化。各组大鼠造模结束后,对以下指标进行检测：(1)小动物肺功能仪检测气道阻力(RL)、肺动态顺应性(Cdyn)和潮气量(VT);(2)HE染色形态学测量小气道壁厚度、MLI和MAN,天狼猩红染色检测小气道区胶原沉积面积；(3)免疫组织化学染色法检测各组大鼠肺组织rCRAMP的表达；(4)分析大鼠肺组织小气道区rCRMP的表达与小气道壁厚度、胶原沉积的相关性,以及肺泡上皮细胞rCRAMP的表达与MLI、MAN的相关性。3.建立人支气管上皮细胞与肺成纤维细胞共培养模型,研究支气管上皮细胞分泌的LL-37对肺成纤维细胞胶原表达的影响,并对其信号传导通路进行探讨。(1)培养人支气管上皮细胞(16HBE),用不同浓度的香烟提取物(CSE)刺激后,免疫荧光染色法检测细胞中LL-37的表达。(2)16HBE细胞与人肺成纤维细胞(HFL-1)在Transwell六孔板中共培养,给予不同浓度的CSE刺激后,ELISA法检测细胞上清液中LL-37的表达,Sircol法测定细胞上清液中胶原的表达。(3)HFL-1细胞在Transwell六孔板下层培养,给予与步骤2相同浓度的CSE刺激后,Sircol法测定细胞上清中胶原的表达。(4)不同浓度的LL-37合成肽、TGF-β1、乱码LL-37合成肽(sLL-37)刺激HFL-1细胞48h后,Sircol法检测细胞上清液中胶原的表达。(5)不同浓度的LL-37合成肽刺激HFL-1细胞48h后,RT-PCR法检测细胞中I、III型胶原基因的表达。(6)分别用甲酰肽样受体(formylpeptidereceptorlike1,FPRL-1)拮抗剂WRW4、ERK阻断剂PD98059、JNK阻断剂SP600125、p38MAPK阻断剂SB203580、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)阻断剂LY294002预处理HFL-1细胞2h后,再给予LL-37合成肽刺激48h,Sircol法测定细胞上清中胶原的表达。(7)不同浓度的LL-37合成肽刺激HFL-1细胞不同时间,Westernblot方法检测细胞裂解物中ERK和磷酸化ERK(pERK)的表达。(8)分别给予FPRL-1受体拮抗剂WRW4、ERK阻断剂PD98059预处理HFL-1细胞2h后再给予LL-37刺激,Westernblot方法检测细胞裂解物中ERK和pERK的表达。4.检测COPD吸烟组、吸烟对照组和不吸烟对照组患者肺组织小气道区和肺泡区成纤维细胞表面标记蛋白,比较不同区域成纤维细胞细胞外基质蛋白的表达情况,探讨COPD患者肺组织成纤维细胞的异质性。(1)采用免疫组织化学双染的方法检测肺组织成纤维细胞波形蛋白(vimentin)、E-钙粘素(E-cadherin)、CD45的表达,分析小气道区和肺泡区成纤维细胞的表型,并计算每种表型成纤维细胞所占的比例；(2)用免疫组织化学染色法对小气道区和肺泡区成纤维细胞I型胶原、Ⅲ型胶原、弹力蛋白、纤维连接蛋白的表达进行检测。结果1.(1)COPD吸烟组与肺功能正常的对照组患者在年龄上无统计学差异,COPD吸烟组与吸烟对照组患者吸烟指数无显著差异。COPD吸烟组患者FEV1%与FEV1/FVC均显著低于肺功能正常的对照组(P<0.01,P<0.01)。(2)与对照组相比,COPD吸烟组患者小气道壁厚度显著增加,MLI显著增加,MAN显著降低(P<0.01)。而上述指标在吸烟对照组和不吸烟对照组之间无统计学差异(P>0.05)。(3)COPD吸烟组患者小气道区胶原沉积面积较对照组显著增多(P<0.01),而肺泡区胶原的表达显著低于对照组(P<0.01)。(4)免疫组化染色结果显示,LL-37主要表达于肺组织小气道上皮细胞、肺泡上皮细胞、炎症细胞(包括中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞)和成纤维细胞。不吸烟对照组患者肺组织LL-37呈弱阳性表达,COPD吸烟组患者肺组织小气道区和肺泡区LL-37的表达显著高于吸烟对照组(P<0.01,P<0.01),吸烟对照组患者小气道区和肺泡区LL-37的表达显著高于不吸烟对照组(P<0.01,P<0.01)。(5)小气道上皮细胞LL-37的平均光密度与小气道壁厚度和胶原沉积面积显著正相关(r=0.62,P<0.01;r=0.73,P<0.01);小气道粘膜下层LL-37阳性细胞数与小气道壁厚度和胶原沉积面积显著正相关(r=0.65,P<0.01;r=0.71,P<0.01)；肺泡上皮细胞LL-37的表达与MLI显著正相关(r=0.64,P<0.01),与MAN显著负相关(r=-0.54,P<0.01)。2.(1)烟熏大鼠体重增长较正常大鼠明显延缓,烟熏6周后大鼠体重与空白对照组相比差异显著(P<0.01)。(2)与空白对照组相比,烟熏1月组大鼠RL和Cdyn均未出现明显改变(P>0.05),烟熏3月组与烟熏6月组大鼠RL分别增加13.5%和21.9%,Cdyn分别下降18.1%和23.8%。烟熏组大鼠潮气量与空白对照组相比无显著差异(P>0.05)。(3)烟熏3个月后,大鼠出现小气道重塑及肺气肿的病理改变,表现为小气道壁增厚,小气道壁周围胶原沉积面积增加,肺泡间隔破坏,肺泡腔扩大,烟熏6个月后上述病理改变更加明显。形态学测量结果显示：烟熏3个月后,大鼠小气道壁厚度和胶原沉积面积较对照组显著增加,且烟熏6月组显著高于烟熏3月组。烟熏3个月后大鼠MLI显著增高,MAN显著降低。与空白对照组相比,烟熏6月组大鼠MLI增加70.7%,MAN下降48.9%。烟熏1月组大鼠小气道壁厚度、胶原沉积面积、MLI和MAN较空白对照组无显著差异(P均>0.05)。(4)烟熏1个月后大鼠小气道区和肺泡区rCRAMP的表达显著高于空白对照组,且随烟熏造模时间的延长,rCRAMP的表达逐渐增加(P<0.01)。(5)大鼠小气道区rCRAMP平均光密度与小气道壁厚度显著正相关(r=0.49,P<0.01),与气道壁周围胶原沉积面积显著正相关(r＝0.50,P<0.01)；肺泡上皮细胞rCRAMP平均光密度与MLI呈显著正相关(r=0.45,P<0.01),与MAN呈显著负相关(r=-0.49,P<0.01)。3.(1)细胞免疫荧光染色结果显示CSE刺激后,16HBE细胞中LL-37的表达显著增强。(2)CSE刺激后,16HBE/HFL-1共培养体系中LL-37的浓度增加,胶原的表达也增加,且LL-37中和抗体显著降低胶原的表达(P<0.05)。(3)CSE刺激后,HFL-1细胞上清液中胶原的表达无明显改变(P>0.05)。(4)LL-37合成肽可促进HFL-1细胞胶原的分泌,呈明显的浓度-效应关系。TGF-β1显著诱导胶原的产生,其诱导效应较LL-37合成肽更强。sLL-37合成肽对HFL-1细胞胶原的产生无明显影响(P>0.05)。(5)LL-37合成肽上调HFL-1细胞I型胶原和ⅡI型胶原mRNA水平,呈剂量-效应关系。(6)FPRL-1拮抗剂WRW4预处理后,与LL-37合成肽刺激组相比,胶原的分泌显著下降,且与WRW4呈浓度依赖性。(7)MAPK阻断剂和PI3K阻断剂预处理后,只有ERK阻断剂PD98059能显著抑制胶原的分泌(P<0.05),其他通路抑制剂对胶原分泌无显著影响(P>0.05)。(8)LL-37合成肽可诱导ERK磷酸化,在作用30min时,磷酸化最明显,且LL-37合成肽对ERK磷酸化的诱导呈浓度依赖性；WRW4和PD98059可抑制LL-37合成肽诱导的ERK磷酸化。4.(1)在不吸烟对照组和吸烟对照组患者的肺组织中只观察到一种表型的成纤维细胞(vimentin+CD45-E-cadherin-),即肺组织来源的成纤维细胞；在COPD吸烟组患者的肺组织小气道区仅观察到vimentin+CD45-E-cadherin-表型的成纤维细胞,而在肺泡区却观察到三种表型的成纤维细胞：vimentirE-cadherin+、vimentin+CD45+、vimentin+CD45-E-cadherin-,即上皮间质转化来源、循环纤维细胞来源和肺组织来源的成纤维细胞。其中vimentin+E-cadherin+表型的成纤维细胞约占24.3%,vimentin+CD45+表型的成纤维细胞约占12.4%,而大约63.3%的成纤维细胞来源于肺组织。(2)与不吸烟对照组和吸烟对照组相比,COPD吸烟组患者小气道区I、Ⅲ型胶原、弹力蛋白、纤维连接蛋白的表达显著增高(P均<0.01),而肺泡区I、Ⅲ型胶原、弹力蛋白、纤维连接蛋白的表达显著降低(P均<0.01)。结论1.COPD患者肺组织异常增高的Cathelicidin(LL-37)与小气道重塑和肺气肿的病理改变显著相关。2.香烟烟气是诱导大鼠肺组织Cathelicidin(rCRAMP)表达增高的原因,rCRAMP与大鼠小气道重塑与肺气肿的病理改变密切相关。3.CSE诱导支气管上皮细胞分泌的Cathelicidin(LL-37)可通过结合上皮下肺成纤维细胞表面的FPRL-1受体并激活ERK信号通路促进胶原表达,从而参与小气道重塑的病理过程。4.COPD患者肺组织小气道区和肺泡区成纤维细胞存在明显的异质性；不同区域的成纤维细胞对高表达的LL-37反应不同,从而导致COPD患者不同区域的肺组织在相似的异常因子网络的环境下,产生不同程度胶原沉积的病理改变。
【作者】孙丛丛；
【导师】肖伟；
【作者基本信息】山东大学，内科学，2014，博士
【关键词】内源性抗菌肽；慢性阻塞性肺疾病；细胞外信号调节激酶；成纤维细胞异质性；甲酰肽样受体；

【参考文献】
[1]朱艺华,田志坚,池凯凯.分布式存储系统中带宽最优的数据修复策略[J].北京邮电大学学报,2013,03:25-29.
[2]周鑫.新加坡反腐机制及其对我国廉政建设的启示[D].河北大学,行政管理,2014,硕士.
[3]韩卓.西安回民历史街区演变特征及其创意发展研究[D].西北大学,城市规划与设计,2014,硕士.
[4]杨丽娟.基于纳米金颗粒与限制性内切酶的电化学生物传感器研究[D].湖南大学,2011.
[5]周华.化痰宽胸法治疗冠心病心绞痛型（胸痹心痛—痰闭胸阳证）的临床研究[D].成都中医药大学,中西医结合临床,2012,硕士.
[6]冯兵.基于多视图的三维重建中特征提取与特征匹配并行化研究[D].宁夏大学,计算机软件与理论,2014,硕士.
[7]黄丹君.图与超图的带宽和问题[D].浙江师范大学,应用数学,2004,硕士.
[8]王浩莲.数据挖掘术探究[J].新疆石油教育学院学报,2005,03:98-101.
[9]王娟.高中语文学习动力探究[D].信阳师范学院,学科教学,2014,硕士.
[10]向珉江,高厚磊,安艳秋,杜强,刘凯,苏将涛.一种提高数据同步精度的自适应插值算法[J].电力系统自动化,2012,08:77-81+91.
[11]张羽.基于生理测量的疲劳与矿工不安全行为关系研究[D].西安科技大学,安全技术及工程,2014,硕士.
[12]赵真真.沿革-拓展-融合[D].湖南师范大学,音乐学,2013,硕士.
[13]葛晓婷.高校学院式教学建筑空间模式研究[D].中央美术学院,建筑设计及其理论,2013,硕士.
[14]张旭亮.新疆绿色食品产业发展初步探讨[D].新疆师范大学,自然地理学,2004,硕士.
[15]牛铁英.一种不对称镍酞菁的合成、表征及其性质的研究[D].东北师范大学,有机化学,2012,硕士.
[16]田立环.商业智能推开制造业应用之门[J].中国制造业信息化,2005,08:36-37.
[17]王永能,苏天汇.微型机在六种晶系点阵常数精密测量中的应用[J].冶金自动化,1985,06:57.
[18]吉迎冬.周期时变凸轮系统的动力行为研究[D].苏州大学,机械设计及其理论,2003,硕士.
[19]魏巍.论我国刑事审判监督程序[D].黑龙江大学,法律,2012,硕士.
[20]良翰.标准化的市场行为研究[J].中国标准化.1995(02)
[21]汪晶.化学法对皮革化学品可生化性的影响[D].陕西科技大学,环境工程,2013,硕士.
[22]陈佳.地方政府行政成本控制的制度分析[D].云南财经大学,政治经济学,2014,硕士.
[23]张昌俊,向平.机车牵引电流测试记录仪[J].铁道通信信号.2004(07)
[24]王鸽.基于新时期人力资源需求的X高校就业指导体系构建[D].西安科技大学,工商管理,2013,硕士.
[25]本报记者李波.碳纳米管接连实现重大突破[N].中国证券报,2013-07-19A14.
[26]张双.Calpain介导小鼠心肌缺血/再灌注氧化应激诱导的细胞凋亡机制研究[D].川北医学院,内科学,2014,硕士.
[27]张国涛.雷达辐射源信号特征综合评价研究[D].西南交通大学,电气系统控制与信息技术,2014,硕士.
[28]马应征.维吾尔族流动人口研究综述[J].新疆社会科学,2014,03:134-139.
[29]王杰.仪式在社会工作中运用的理论探讨与实践反思[D].苏州大学,社会工作（专业学位）,2014,硕士.
[30]胡文斌.基于STM32储能点焊控制系统开发与研究[D].南昌航空大学,材料加工工程,2013,硕士.
[31]刘云圻.化学气相沉积法可控合成石墨烯及其电子学性能[A].中国化学会.第十三届固态化学与无机合成学术会议论文摘要集[C].中国化学会:,2014:1.
[32]李敏,王晓丽.“教育部高等学校艺术学理论类专业教学指导委员会第四次工作会议暨艺术学理论类专业建设高峰论坛”会议纪要[J].艺术探索,2015,01:59-74.
[33]张军平.多电飞机电气负载管理中心的研究[D].西北工业大学,电力电子与电力传动,2004,硕士.
[34]陈峙屹.基于公钥的RFID认证技术研究与实现[D].西安电子科技大学,信息安全,2012,硕士.
[35]王实,高文,郎金文,李锦涛.在线零售站点的自适应和商业智能的发现[J].计算机科学,2002,01:30-35+38.
[36]罗萌.老龄科学和心理学中的“积极”思潮[J].老龄科学研究,2014,05:47-55.
[37]李露.湖南黔城古城的街巷空间特色解析[D].湖南师范大学,设计艺术学,2014,硕士.
[38]陶瑞东.滨海深部构造超深井钻井技术研究与应用[D].东北石油大学,石油与天然气工程（专业学位）,2013,硕士.
[39]陈晓琴.青海湖流域生态环境敏感性评价研究[D].青海师范大学,地图学与地理信息系统,2012,硕士.
[40]邢通.星载单机多余物检测系统的研究[D].哈尔滨工业大学,电机与电器,2013,硕士.
[41]罗茂政.基于多融合中心的航迹与航迹关联[D].西安电子科技大学,计算机应用技术,2009,硕士.
[42]阮一平.基于不同橡胶发泡吸油材料的制备及其性能研究[D].宁波大学,物理化学,2014,硕士.
[43]韩正庆,高仕斌,李群湛.基于差动电流正弦曲线拟合波形的变压器保护原理[J].电力系统自动化,2005,12:29-32.
[44]曹伟,宋雪梅,王波,严辉.碳纳米管的研究进展[J].材料导报,2007,S1:77-82.
[45]梁春慧,孙艳,万跃华.高被引论文的参考文献特征研究——以化学领域为例的实证分析[J].科技与出版,2014,07:119-122.
[46]单环宇.抗寄生虫药硝唑尼特的合成工艺研究[D].浙江大学,化学工程（专业学位）,2014,硕士.
[47]赵哲.基于关键链技术的EPC进度管理研究[D].河北工程大学,企业管理,2012,硕士.
[48]安志霞.中国大豆价格波动性研究[D].北方工业大学,数量经济学,2013,硕士.
[49]肖茜茜.基于SFA模型的我国证券公司效率及其影响因素研究[D].山东财经大学,数量经济学,2014,硕士.
[50]夏华庆.关于右完全码的若干问题[D].杭州师范大学,基础数学,2005,硕士.