利用TALEN技术对家兔CCR5和猪Albumin基因进行靶向修饰

【摘要】类转录激活因子效应物核酸酶（Transcriptionactivator-likeeffectornuclease，TALEN）技术是近几年发展起来的一种可对基因组进行定点修饰的技术，是基于植物病原体黄单胞菌（Xanthomonas）分泌的一种转录激活子样效应因子（Transcriptionactivator-likeeffector，TALE）而设计和构建的，主要由特异性的TALE蛋白DNA结合结构域和非特异性的FokI核酸内切酶切割结构域两部分组成。TALEN可特异性结合靶DNA序列，并在特定位点对DNA双链进行切割，形成双链断裂（Double-strandbreaks，DSBs），双链断裂可启动细胞内非同源末端连接（Non-homologousendingjoining，NHEJ）或同源重组（Homologousrecombination，HR）修复机制，从而可通过NHEJ或HR修复促进基因敲除、基因敲入等事件的发生。本课题采用高效的基因打靶技术-TALEN，对家兔CCR5基因和猪白蛋白（albumin）基因进行靶向修饰。探讨在家兔CCR5基因位点定点敲入人CD4和人CCR5基因编码区序列（Codingsequences，CDS），获得HIV-1感染动物模型的可能性；在猪白蛋白基因位点定点敲入人albumin基因，获得在猪血液中表达人血清白蛋白（Humanserumalbumin，HSA）动物模型的可能性。针对家兔CCR5基因，设计了两对TALENs和一个同源打靶载体，将体外转录的TALENmRNAs和纯化的DNA同源片段显微注射到家兔受精卵中，体外培养3~5d后，收集24枚胚胎，对胚胎的基因突变情况进行PCR和测序分析。结果显示，在家兔CCR5基因位点，24枚胚胎均发生了基因敲除，5枚胚胎还发生了人CD4和人CCR5基因定点敲入。说明通过此方法获得人CD4和CCR5基因定点敲入兔是可行的，所以接下来将显微注射后的受精卵移入代孕母兔，以期能获到在家兔CCR5基因位点定点敲入人CD4和CCR5基因CDS的基因敲入仔兔。该结果为建立艾滋病研究新动物模型奠定了基础。针对猪albumin基因，设计了一对TALENs和一个同源打靶载体，将TALENs和打靶载体共转染至猪胎儿成纤维细胞中，转染后的细胞采用嘌呤霉素筛选，得到2株在猪albumin基因位点定点敲入人albumin基因CDS的阳性克隆。利用此阳性克隆进行体细胞核移植和胚胎移植，经过114天左右的孕期后，获得了2头阳性的基因定点敲入猪。从猪血液中提取血清白蛋白，质谱分析结果显示阳性猪表达人血清白蛋白。该结果为获得新的人血清白蛋白动物生物反应器奠定了基础。
【作者】唐成程；
【导师】赖良学；
【作者基本信息】吉林大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】TALEN；家兔；CCR5；猪；albumin；

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