单链抗体融合蛋白ScFv-9R在大肠杆菌中的高效表达和介导siRNA靶向RT112细胞的研究

【摘要】成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)是一个被熟知的原癌基因，FGFR3的信号通路对细胞的发育起着至关重要的作用，它跟许多肿瘤的发生有密切的关系。因此，越来越多的研究人员开始意识到受体激酶抑制剂的潜在应用价值，以及把研究重点聚焦到能够靶向抑制FGFR3信号传导的单克隆抗体或单链抗体上。在本论文研究中，我们设计了一种新的融合蛋白（ScFv-9R），这个蛋白含有能够靶向FGFR3的单链抗体又含有能够结合siRNA的9个精氨酸的短肽。单链抗体(singlechainantibodyfragment，ScFv)，是通过十五个左右氨基酸的短肽(linker)将抗体的重链可变区和轻链的可变区连接而成，它不仅保留了特异性识别抗原的特性，而且具有自身体积小、穿透力强、免疫原性低等优点。精氨酸为碱性氨基酸，在中性条件下带正电荷，能够与带负电荷的核酸结合。因此由9个精氨酸形成的短肽能够结合siRNA。传统的原核表达系统得到的蛋白大都不能够正确的折叠而以包涵体的形式存在于沉淀中，为后续实验带来了很多不便。为了让目的蛋白能够可溶性表达并且得到更高的产量，我们建立了一种可溶性表达系统，通过PCR反应在基因水平上将ScFv和ScFv-9R融合了SUMO（小泛素修饰复合物）并且在大肠杆菌BL21中表达。重组细菌经过0.5mM的IPTG（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside）20°C诱导20小时，收集目的蛋白Sumo-ScFv和Sumo-ScFv-9R的上清液依次通过阴离子交换层析DEAE和亲和层析（Ni-NTA）得到纯度较高的目的蛋白。将得到的Sumo-ScFv和Sumo-ScFv-9R经过Sumo蛋白酶消化，将融合蛋白SUMO与目的蛋白ScFv和ScFv-9R分离，从而得到ScFv和ScFv-9R。ScFv和ScFv-9R的纯度高于95%，浓度大约为4mg/L。体外实验表明，在存在或者缺少FGF9的情况下ScFv-9R能够使FGFR3和ERK的磷酸化水平降低，抑制或者减弱FGFR3的信号通路。通过凝胶阻滞实验，我们可以看出目的蛋白ScFv-9R在结合siRNA的情况下呈现明显拖带的现象，表明ScFv-9R能够结合siRNA，1μg的ScFv-9R能够结合4pmolsiRNA。通过荧光显微镜技术可以发现ScFv-9R能够有效地携带siRNA进入FGFR3高表达的RT112（膀胱癌细胞系）细胞中，但是却不能结合以及进入到FGFR3阴性的细胞如THP1细胞（人急性白血病细胞系）。综上所述，我们利用Sumo融合表达系统在大肠杆菌中能够获得具有高产量的、可溶性的融合蛋白ScFv-9R。该蛋白具有双重功能，在携带药物的同时能够靶向结合FGFR3阳性的肿瘤细胞，是一个高效的药物传递系统。我们的结果显示ScFv-9R作为一个新型的药物载体，在治疗肿瘤以及药物的开发方面具有很好的潜在应用价值。
【作者】张喜光；
【导师】李校堃；
【作者基本信息】吉林大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】sumo融合；可溶性表达；siRNA；双重功能的ScFv-9R；

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