二甲双胍诱导胃癌细胞MKN-45发生细胞自噬及其机制的研究

【摘要】目的：探讨二甲双胍对胃癌细胞自噬作用及促进胃癌细胞凋亡的影响及其可能作用的机制。方法：取对数生长期的人胃癌细胞MNK-45,接种于培养板中：采用不同浓度二甲双胍(2mmol/L、4mmol/L、8mmol/L、16mmol/L、32mmol/L、64mmol/L)分别干预24、48、72h为实验组,用等量DMEM培养基处理为对照组,MTT检测肿瘤细胞的抑制率,计算二甲双胍对胃癌细胞的ICso值为17mmol/L分别采用17mmol/L二甲双胍和等量DMEM培养基干预胃癌细胞MNK-4548h。流式细胞仪检测两组细胞的凋亡情况；RT-PCR检测两组细胞中bax和bcl-2的mRNA表达水平；Westernblot检测Beclinl、Ⅰ型LC3b、Ⅱ型LC3b、Bax、Bcl-2、caspase3、AKT、p-AKT、mTORp-mTOR、P70S6K、p-P70S6K蛋白的表达水平。在实验组中加入自噬抑制剂3-MA(5mmol/L)抑制二甲双胍诱导的自噬,用Westernblot检测Bax、Bcl-2、caspase3蛋白的表达水平。结果：MTT检测不同浓度二甲双胍(2mmol/L、4mmol/L、8mmol/L、16mmol/L、32mmol/L、64mmol/L)分别干预胃癌细胞MNK-4524h后细胞抑制率分别为3.0%±1.1%、8.6%±1.7%、15.9%±1.6%、26.1%±3.4%、37.5%±2.3%、49.7%±3.6%,干预48h后细胞抑制率分别是5.2%±1.9%、10.4%±2.1%、26.9%±1.6%、49.5%±1.6%.59.1%±2.0%.82.1%±2.2%,干预72h后细胞抑制率分别是9.5%±2.2%、17.6%±1.4%、30.6%±2.6%、78.9±1.%4、93.3%±2.7%,同时间点6组比较,差异有统计学意义(F=155.174,F=728.229,F=743.826,p<0.05)。流式细胞仪检测实验组和对照组胃癌细胞MNK-45的凋亡率分别为25.4%±1.7%和6.9%±0.5%,两组比较,差异有统计学意义(t=18.378,p<0.05)。实时荧光相对定量PCR检测实验组和对照组胃癌细胞MNK-45中凋亡相关基因bax/bcl-2mRNA相对表达的比值分别为1.88±0.16和1.00±0.00,两组比较,差异有统计学意义(t=9.743,p<0.05)。Westernblot检测实验组和对照组MKN-45细胞中自噬蛋白LC3Ⅱ/LC3I的相对表达量比值分别为1.65±0.08和0.79⒈0.03;Beclinl蛋白的相对表达量分别1.47±0.06和0.56±0.06两组比较,差异有统计学意义(t=18.023,18.283,p<0.05);实验组和对照组中凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2相对表达量比值分别为2.32+0.29和0.84±0.11,两组比较,有统计学差异(t=8.269,p<0.05).Caspase3蛋白相对表达量分别为1.21±0.20和0.77±0.13,两组之间比较,有统计学差异(t=3.327,p<0.05)。实验组中加入自噬抑制剂3-MA和不加3-MA,Bax/Bcl-2相对表达量比值分别为0.72±0.18和1.52+0.24,两者比较,有统计学意义(t=4.653,p<0.05);Caspase3蛋白相对表达量分别为1.15±0.17和2.46±0.32,两者比较,有统计学意义(t=6.210,p<0.05)。AKT蛋白分别为0.80±0.14和0.96±0.17,P70S6K蛋白分别为0.97±0.21和1.37±0.23,两组比较,差异无统计学意义(t=2.103,1.699,p>0.05);mTOR蛋白分别为0.58+0.11和1.88±0.23,p-mTOR蛋白分别为0.57±0.15和2.36±0.25,两组比较,差异有统计学意义(t=-11.293,10.979,p<0.05)；实验组胃癌细胞MNK-45中p-AKT和p-P70S6K不表达,对照组分别为1.00±0.00和1.00±0.00。结论：二甲双胍能够诱导胃癌细胞MKN-45发生自噬,抑制其增殖,并促进其凋亡；其作用机制可能与二甲双胍激活AMPK通路,抑制了mTOR表达从而影响mTOR下游蛋白(P70S6K)磷酸化的表达水平,诱导胃癌细胞发生自噬。
【作者】徐学超；
【导师】李玉民；
【作者基本信息】兰州大学，外科学，2014，硕士
【关键词】自噬；凋亡；胃癌；二甲双胍；

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