大鼠肝切除术后肝血窦重建的实验观察及初步机制研究

【摘要】目的：观察大鼠肝切除术后肝血窦重建的形态学过程和门静脉血流动力学改变规律；探讨肝切除术后,肝再生过程中VEGF和TGF-β1的表达及其与肝血窦重建的关系；建立一种高效率、高纯度分选HSECs的新方法。方法：按照随机的办法将35只实验动物分为实验组(n=28)和对照组(n=7)。实验组用于构建2/3肝切除模型,将它们再按照随机的办法平均分配到术后24、72、120和168h四个时间点。对各组大鼠在相应的时间点行腹部彩超检测门静脉血流量,然后将其处死留取标本,并计算肝再生率；用免疫组化染色检测标本CD32的表达以计算肝血窦密度,用免疫组化染色检测残肝PCNA的表达,进而检测肝细胞及肝窦内皮细胞的增殖；用qRT-PCR检测残肝VEGFmRNA和TGF-β1mRNA;分别用免疫组化和Western-blot检测残肝VEGF和TGF-β1的表达。另取5只实验动物构建原位灌注模型,在胶原酶灌注结合Percoll密度梯度离心的基础上,采用流式细胞分选的方法进行HSECs的原代分离；分别在倒置相差显微镜和扫描电镜下观察分选的HSECs形态学变化及其超微结构。结果：肝切除术后门静脉血流开始下降,至术后24h下降到最小值,然后逐渐升高,至120h达到高峰后逐渐下降至正常水平；肝切除术后肝再生率逐渐增大,168h达到最大值；免疫组化染色提示：PCNA表达阳性肝细胞数在肝切除术后24h达到最大值,PCNA表达阳性HSECs数于术后72h达到最大值；CD32只在HSECs的细胞膜阳性表达,残肝血窦密度于术后24h降到最低,然后开始缓慢升高,168h达到最大值。QRT-PCR检测的VEGFmRNA和TGF-β1mRNA分别在肝部分切除术后约72和120h达到高峰。免疫组化和Western-blot检测结果表明,VEGF表达水平在术后0-72h逐渐升高,且在72h达到峰值；TGF-β1的表达在术后0～120h缓慢上升,约在术后120h达到高峰。流式细胞分选回收率为63.30±1.39%,细胞活性为94.48±2.07%,倒置相差显微镜下HSECs呈“鹅卵石”样排列,扫描电镜下可观察到HSECs特征性的窗孔结构。结论：在肝切除诱导肝再生过程中,随着肝细胞再生的启动和发展,肝血窦稍后逐步重建为正常结构,而门静脉主干血流量呈现先降低,而后随着血窦重建逐步恢复正常；VEGF和TGF-β1可能通过再生肝细胞调控肝血窦重建过程；流式细胞分选是一种高效率、高纯度分选HSECs的新方法。
【作者】张冬红；
【导师】焦作义；
【作者基本信息】兰州大学，外科学，2014，硕士
【关键词】肝切除；肝再生；血窦重建；肝窦内皮细胞；流式细胞术；细胞分选；

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