脓毒症大鼠小肠上皮自噬水平及脑肠肽Ghrelin对其调节作用的研究

【摘要】第一部分：脓毒症大鼠小肠上皮细胞的自噬水平研究目的：研究盲肠结扎穿刺(Cecalligationandpuncture,CLP)诱导的脓毒症大鼠小肠上皮自噬水平的变化,探讨自噬与脓毒症肠上皮损害的关系。方法：雄性SD大鼠60只随机分成对照组,CLP4h组、CLP8h组、CLP12h组、CLP16h组及CLP20h组(n=10)。建立大鼠盲肠结扎穿刺模型后,在各时间点随机处死大鼠,收集大鼠血清及小肠肠段,低温下刮取小肠上皮粘膜保存待检。酶联免疫吸附法检测血清及粘膜细胞因子变化,Western-blot法及Realtime-PCR法从蛋白及基因水平检测粘膜组织中自噬相关蛋白LC3表达量,统计学分析各组间差异；透射电子显微镜观察脓毒症8h和20h大鼠肠上皮细胞微细胞结构变化及自噬泡形态,并统计自噬泡及自噬溶酶体数量。结果：CLP诱导的脓毒症大鼠血清及粘膜细胞因子TNF-a和MCP-1在4h即升高,明显高于对照组(P<0.05),自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3在脓毒症8h明显高于对照组(1.255±0.088vs1.470±0.295,P=0.038,n=4),12h后下降；LC3基因转录水平较对照组升高(0.120±0.069vs3.104±1.191,P=0.00,n=10),随之下降。电镜观察CLP8h和20h肠上皮细胞,线粒体损伤明显,肿胀溶解,内质网空泡化,CLP8h小肠上皮细胞内自噬泡和自噬溶酶体数量较20h组明显增多(19.33±2.16vs9.33+1.86,37.67±3.27vs19.50±1.87,P=0.00,n=3),CLP20h细胞内也可见较大的自噬溶酶体。结论：脓毒症大鼠小肠局部及全身炎性因子TNF-a早期达高峰,小肠粘膜自噬相关蛋白LC3在蛋白和基因水平表达早期升高,随后下降。自噬在脓毒症病理环境下受到炎性细胞因子变化影响,与TNF-a水平正相关。第二部分：脑肠肽Ghrelin对脓毒症大鼠肠上皮细胞自噬的调节作用目的：研究脑肠肽Ghrelin对脓毒症大鼠肠上皮自噬的调节作用,探讨Ghrelin通过调节细胞自噬对脓毒症大鼠肠道发挥保护作用。方法：将40只雄性SD大鼠随机分成正常组、假手术组、CLP20h组及Ghrelin干预组,通过大鼠盲肠结扎穿刺术建立脓毒症动物模型,并经大鼠尾静脉持续泵注Ghrelin20h,随后处死各组动物,收集大鼠血清及小肠组织；截取部分小肠段固定后待行病理及电镜观察,另一部分小肠在低温下刮取肠粘膜待行分子生物学检测。光学显微镜观察各组小肠上皮的病理改变,透射电子显微镜观察小肠上皮微细胞结构变化及细胞内自噬泡形态和数量。免疫荧光观察小肠上皮细胞内GFP-LC3表达水平。Western-blot及Real-timePCR检测小肠粘膜自噬相关蛋白LC3水平,酶联免疫吸附法检测各组动物血清和粘膜内炎症因子水平的变化,统计学分析各组间差异。结果：(1)与正常组及假手术组相比,脓毒症20h大鼠肠上皮病理损伤明显,血清及粘膜TNF-a(154.57±19.54vs88.58±8.19、96.08±9.93,74.95±4.89vs19.94±1.10、22.44±4.18,P=0.00,n=10)和MCP-1(96.33±4.89vs61.66±6.94、69.16±10.42,66.74±4.80vs41.74±1.78、49.24±4.32,P=0.00,n=10)水平升高,LC3蛋白表达升高(1.52±0.03vs0.98±0.18、1.25±0.09,P=0.00,n=4),其基因转录水平也升高(0.42±0.16vs0.13±0.11、0.13±0.12,P=0.00,n=10)。脓毒症大鼠小肠上皮GFP-LC3表达较假手术组升高(210±18.03vs168±17.66,P=0.003,n=5)。小肠上皮细胞自噬泡及自噬溶酶体数量较假手术组升高(36.83±3.76vs9.33±1.86,71.83±5.27vs19.50±1.87,P=0.00,n=3)。(2)与脓毒症组比较,小肠上皮粘膜毛细血管充血减轻。血清及肠粘膜组织TNF-a(154.57±19.54vs192.75±21.91,74.95±4.89vs96.85±15.35,P=0.00,n=10)和MCP-1(96.33±4.89vs189.93±14.59,66.74±4.80vs99.08±7.47,P=0.00,n=10)降低,LC3蛋白表达升高(1.52±0.03vs1.35±0.06,P=0.035,n=4),LC3基因转录水平(0.42±0.16vs0.14±0.10,P=0.00,n=10)。肠上皮细胞GFP-LC3表达增多(210±18.03vs177.80±17.66,P=0.014,n=5)。Ghrelin组肠上皮细胞内自噬泡及自噬溶酶体数量明显升高(36.83±3.76vs19.33±2.16,71.83±5.27vs37.67±3.27,P=0.00,n=3)。结论：脑肠肽Ghrelin明显减轻脓毒症大鼠小肠上皮病理损害,降低局部及全身炎症因子水平,促进小肠上皮细胞自噬相关蛋白LC3表达及转录,增加细胞内自噬泡及自噬溶酶体数量,具有上调脓毒症大鼠小肠上皮细胞自噬的作用。
【作者】万晟霞；
【导师】石斌；
【作者基本信息】兰州大学，外科学（专业学位），2014，硕士
【关键词】盲肠结扎穿刺术；脓毒症；小肠上皮；自噬；Ghrelin；

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