NLRP3炎症小体对糖尿病性心肌病的影响及其机制研究

【摘要】研究背景糖尿病性心肌病(diabeticcardiomyopathy,DCM)是由糖尿病引起的,并以心肌重构和心功能下降为特征,最终导致心力衰竭的心肌病变。糖尿病状态下,高糖刺激活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)生成增多被认为是DCM发生和发展的重要原因。过多的ROS刺激多种炎症因子表达升高,如核因子kB(nuclearfactorkappa-light-chain-enhancerofactivatedBcells,NF-kB)、硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxininteracting/inhibitingprotein,TXNIP)及炎症小体。既往研究表明,炎症小体与胰岛素抵抗、2型糖尿病及糖尿病并发症关系密切。但目前炎症小体在DCM中的作用及其调控机制尚未见报道。炎症小体是一类分布于细胞胞浆中的蛋白复合体,它可以感受细胞内多种与免疫及死亡相关的信号刺激,参与细胞功能调控。目前已发现多个炎症小体家族成员,主要包括：NLRs(nucleotidebindingoligomerizationdomain-likereceptors)家族及AIM2(absentinmelanoma2)家族。NLRP3(NOD-likereceptorprotein3)是NLRs家族中的一员。当接收到相关信号刺激后,NLRP3将与含CARD结构域的凋亡相关颗粒样蛋白(apoptosis-associatedspeck-likeproteincontainingCARD,ASC)及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(cysteinylaspartatespecificproteinase-1,caspase-1)组成炎症复合体,促进caspase-1前体(pro-caspase-1)的自我剪切,形成具有活性的caspase-1p20/p10复合物,最终促进白介素1β(interleukin1β,IL-1β)前体蛋白pro-IL-1β水解成具有活性的IL-1p。既往研究表明,IL-1p在心肌细胞凋亡中具有重要作用。NLRP3炎症小体的异常激活通常表现在两个方面：一方面,NLRP3表达上调；另一方面,NLRP3炎症小体形成复合物,促进caspase-1及IL-1p等效应分子的产生。在巨噬细胞中,NF-kB可促进NLRP3表达上调。在HEK293T细胞中,TXNIP可促进NLRP3炎症复合物的形成,最终促进caspase-1及IL-1β等效应分子的产生。但是在高糖刺激的心肌细胞中,NF-kB及TXNIP是否与NLRP3炎症小体的激活相关,目前尚未见报道。近期研究显示,caspase-1除了可以促进IL-1β成熟外,还可以促进细胞程序性死亡,这一过程被称为“细胞焦亡(pyroptosis)”。细胞焦亡是一种与炎症相关,依赖于caspase-1的程序性死亡方式。焦亡的细胞同时具备细胞凋亡及细胞坏死的部分形态特征。这主要表现在：细胞焦亡存在DNA片段化损伤,并在脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的粘性末端标记检测(terminaldeoxynucleotidyltransferase-mediateddUTP-biotinnickendlabeling,TUNEL)中呈现阳性；细胞焦亡时胞膜完整性消失,胞内炎症物质会通过膜上的孔隙释放到细胞间质,胞外物质会从孔隙渗入胞浆,促进细胞器及细胞浆肿胀,最终导致细胞破裂。因此,不能通过完整细胞膜而只能通过形成孔隙的胞膜的染料可将活细胞与焦亡细胞区分开,如EthD-Ⅲ染料,它可将焦亡细胞染成阳性,但不能将正常细胞染色。焦亡现象最初是在巨噬细胞及树突细胞等髓系细胞受到病原体刺激后观察到的。近期研究显示,一些非病原体也可刺激非髓系细胞出现焦亡现象。但是,高糖刺激的心肌细胞是否发生焦亡,目前未见报道。在糖尿病小鼠及大鼠模型中,心肌组织的电镜结果显示大量心肌细胞呈现与焦亡细胞类似的形态特征,如线粒体肿胀空泡化、肌纤维紊乱溶解、细胞肿胀、及细胞膜模糊不清等。此外,我们在预实验中发现细胞焦亡关键因子caspase-1在DCM大鼠模型心肌组织中表达升高。据此,我们提出假设：糖尿病状态下,心肌细胞ROS生成增多。ROS通过NF-kB及TXNIP促进NLRP3炎症小体过度激活。NLRP3炎症小体的异常激活通过促进心肌间质炎症反应、心肌细胞焦亡及心肌纤维化等途径导致心脏结构和功能异常。研究目的(1)建立2型DCM模型,探究NLRP3炎症小体在DCM病程不同阶段的表达水平；(2)利用NLRP3-miRNA’慢病毒对DCM大鼠进行体内干预,探究NLRP3炎症小体在DCM中的作用；(3)探究NLRP3炎症小体影响DCM发生发展的相关机制。研究方法2型糖尿病大鼠模型将120只5周龄雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为4组(每组30只)：对照组(control组)、糖尿病组(DM组)、糖尿病+空载体慢病毒组(DM+vehicle组)及糖尿病+NLRP3-miRNA慢病毒组(DM+NLRP3-miRNA组)。Control组给予基础饮食,主要成分为：5%脂质,不添加胆固醇。其余3组给予高脂饮食喂养,主要成分为：16%脂质及0.25%胆固醇。4周后4组大鼠均行腹腔葡萄糖耐量实验(Intraperitonealglucosetolerancetest,IPGTT)及腹腔胰岛素耐量实验(Intraperitonealinsulintolerancetest,IPITT)。DM组、DM+vehicle组及DM+NLRP3-miRNA组出现胰岛素抵抗的大鼠接受单次腹腔STZ注射,剂量为35mg/kgo1周后,检测4组大鼠的空腹血糖(BG)及胰岛素(insulin,INS),计算胰岛素敏感指数(ISI),ISI=In[(INS×BG)”1]。DM组、DM+vehicle组及DM+NLRP3-miRNA组大鼠连续两次空腹血糖≥11.1mmol/L,且存在胰岛素抵抗则认为2型糖尿病造模成功。糖尿病性心肌病模型糖尿病大鼠造模成功后,继续给予高脂喂养。至STZ注射后8周,检测大鼠心功能,糖尿病大鼠出现左室舒张功能障碍则提示开始进展为DCM。至STZ注射后16周,检测大鼠心脏结构及功能,糖尿病大鼠心脏组织呈现心肌间质纤维化及左室肥厚的,并出现左室收缩及舒张功能障碍,则提示DCM模型已经成功建立。基因沉默技术根据RNAi干扰技术的原则,设计4对针对大鼠NLRP3基因的miRNA片段,并分别构建4对pcDNA6.2-GW/EmGFP-NLRP3-miRNA质粒,经筛选后,选择沉默效率最高的质粒,随后构建pDONR221-EmGFP-NLRP3-miRNA重组穿梭质粒,最终构建pLenti6.3—EmGFP-NLRP3-miRNA慢病毒载体。慢病毒干预在STZ腹腔注射8周后,分别给予DM+vehicle组及DM+NLRP3-miRNA组慢病毒空载体(vehicle)或NLRP3-miRNA慢病毒(NLRP3-miRNA)干预8周。病毒干预8周后,对DM+vehicle组及DM+NLRP3-miRNA组全部大鼠实施安乐死,随机抽取部分control及DM组大鼠(每组10只)实施安乐死。立即心脏取材,行冰冻切片检测心肌病毒转染效率。NLRP3炎症小体表达趋势Control组及DM组大鼠,分别在STZ注射后的第0、4、8、12、16及20周时取材,每组取3只,然后进行相关指标的检测。血清学检测待实验结束时,大鼠饥饿过夜,抽取外周静脉血,分别检测血清中血糖(bloodglucose)、甘油三酯(triglyceride,TG)及总胆固醇(totalcholesterol,TC)含量。酶联免疫吸附试验(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,ELISA)利用ELISA测定大鼠外周血血清中胰岛素的水平。心脏彩超大鼠经10%水合氯醛麻醉后,行经胸心脏彩超,收集LVEDd、LVEF、F/S、E/A及E’/A’等数据评价大鼠左室功能。组织学检测大鼠实施安乐死后,立即心脏取材,随后称重、测量心脏大小并留取图像。于乳头肌水平横切心脏,制成石蜡切片,于乳头肌平面连续切片,行苏木精-伊红(hematoxylin-eosinstaining,H&E)染色后留取图像。心肌纤维化对左室心肌组织行Masson染色、天狼猩红染色,使用图像分析软件对染色结果进行分析,评价左室心肌纤维化程度。透谢电镜大鼠实施安乐死后,立即取出心脏,于左室壁取1mm3小组织块,立即放入戊二醛固定液中,为透射电镜下观察左室心肌超微结构做准备。免疫组织化学利用免疫组织化学的方法,观察caspase-1及IL-1β在组织中的分布。实时定量RT-PCR取新鲜左室心肌组织,利用实时定量RT-PCR的方法检测大鼠左室心肌中NLRP3,ASC,caspase-1及IL-1βmRNA表达水平。Westernblot取新鲜左室心肌组织,利用Westernblot方法检测大鼠左室心肌中TXNIP、NF-kB、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1及IL-1β的表达。TUNEL检测利用TUNEL检测大鼠左室组织中,心肌细胞核出现DNA损伤的情况。细胞培养及干预培养大鼠H9c2心肌细胞系,分为3组：基础糖培养组(control组)、中等浓度糖刺激组(medianglucose,MG组)及高浓度糖刺激组(highglucose,HG组)。在进行干预前,利用无血清基础糖培养基进行饥饿处理。随后给予含不同浓度葡萄糖的培养基进行不同时间梯度的干预。在ROS抑制实验中,我们选择N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)作为抑制剂对心肌细胞进行预处理。心肌细胞病毒转染利用vehicle或NLRP3-miRNA慢病毒对心肌细胞进行干预,以探究NLRP3在心肌细胞中的作用及调控机制。免疫荧光利用免疫荧光技术观察caspase-1在心肌细胞中的分布。Caspase-1活性检测利用caspase-1活性检测试剂盒检测高糖刺激下caspase-1的活性。ROS检测利用DCFH-DA检测高糖刺激下心肌细胞ROS的产生。细胞焦亡检测利用TUNEL检测心肌细胞核DNA损伤,利用EthD-III染色监测心肌细胞胞膜损伤,利用calcein-AM检测细胞活性。数据分析利用SPSSv18.0处理数据,连续变量以均数±标准误来表示。利用单因素方差分析(one-wayANOVA)和Tukey-Kramerposthoc检验比较多组间的连续变量。利用独立样本t检验比较两组间的连续变量。当p<0.05时认为有统计学意义。研究结果高脂饮食4周可诱导大鼠出现胰岛素抵抗IPGTT结果显示,与基础饮食相比,高脂喂养大鼠4周后,在IPGTT的Omin、30min、60min、120min时血糖值均明显升高(p<0.05～p<0.01)；血糖曲线下面积(AUC)明显增大(p<0.01)。IPITT实验也呈现类似结果(p<0.05～p<0.01)。NLRP3炎症小体及IL-1β在糖尿病性心肌病中表达增高与对照组相比,糖尿病大鼠在STZ注射后第4或第8周起即出现NLRP3、ASC、caspase-1及IL-1β表达升高(p<0.01)。此外,NLRP3炎症小体各组分及IL-1β的mRNA水平多在STZ注射后第8周时达到顶峰,并持续高表达至第20周(p<0.01)。与control组相比,NLRP3、ASC、pro-caspase-1、活化的caspase-1(caspase-1p20)及活化的IL-1β(IL-1βp17)在DM组中表达升高,且多在STZ注射后第8周达到顶峰,并持续高表达至第20周(p<0.01)。NLRP3基因沉默不能改善糖尿病引起的代谢异常在DM组大鼠中,血糖、血脂及胰岛素水平均显著高于control组(p<0.01),胰岛素敏感指数显著低于control组(p<0.01)。利用NLRP3-miRNA进行体内干预后,并不能改善糖尿病引起的代谢异常。基因干预能有效抑制心肌组织NLRP3表达与vehicle干预组相比,NLRP3-miRNA干预后,心肌组织中NLRP3的mRNA及蛋白水平明显降低(p<0.01)。此外,心肌组织中caspase-1和IL-1β的表达也明显降低(p<0.01)。免疫组化结果显示,在糖尿病大鼠的心肌组织中,caspase-1主要分布在细胞核周围,IL-1β主要呈弥散分布(p<0.01)。NLRP3基因沉默可改善DCM左室功能异常与control组比较,DM组的LVEF、FS、E/A及E’/A’均降低(p<0.01),LVEDd增大(p<0.01)。将NLRP3基因沉默后,糖尿病引起的LVEF、FS、E/A及E’/A’降低均明显增加(p<0.05-p<0.01),LVED明显降低(p<0.01)。NLRP3基因沉默改善DCM心肌重构与control组比较,DM组心肌重构的特点是：心肌细胞DNA损伤增多,心肌细胞超微结构受损,1型及3型胶原表达增加,1型及3型胶原比例增高,间质纤维化增多,心脏向心性肥厚,心身比增大等。与vehicle组相比,NLRP3基因沉默可明显改善DCM心肌重构,主要表现为：心肌细胞DNA损伤减少,1型及3型胶原表达降低,1型及3型胶原比例降低,间质纤维化减少,身心比降低等。高糖刺激心肌细胞NLRP3炎症小体及L-1β表达增高与control组相比,MG或HG刺激24至48小时,可引起H9c2心肌细胞NLRP3,ASC,caspase-1及IL-1β的mRNA表达升高,且此升高呈现糖浓度依赖性(p<0.01)。MG或HG刺激心肌细胞24至48小时,NLRP3炎症小体各组分及IL-1βp17的表达较control组均升高(p<0.01)。HG刺激时,NLRP3、ASC及IL-1βp17在36小时表达量最高,并持续到48小时(p<0.05)。据此,在后续的实验中,我们选择HG为刺激条件,36小时为刺激时间。与基础培养基相比,与MG、HG渗透压匹配的甘露醇并不能引起NLRP3炎症小体及IL-1p表达升高。高糖刺激诱导H9c2细胞caspase-1表达升高及细胞焦亡与control及MG组比较,HG组中的caspase-1p20表达明显增高(p<0.05～p<0.01)。免疫荧光结果显示,MG及HG可促进caspase-1在心肌细胞胞质中聚集,同时我们还发现,与control组相比,心肌细胞核DNA的损伤及心肌细胞膜的破坏随着caspase-1表达升高而加重(p<0.01)。NLRP3在高糖引起的细胞焦亡中发挥重要的作用我们利用NLRP3-miRNA抑制心肌细胞内NLRP3的表达,探究NLRP3在心肌焦亡中的作用。在确保病毒转染效率达80%以上的前提下,NLRP3-miRNA能够有效抑制靶基因mRNA及蛋白的表达(p<0.01)。随着NLRP3蛋白的抑制,高糖刺激下caspase-1及IL-1β的活性也明显受到抑制(p<0.05-p<0.01)。与此同时,高糖刺激下心肌细胞核DNA损伤及细胞膜受损较之前有明显的改善(p<0.05)。NF-kB及TXNIP在ROS刺激NLRP3激活中发挥重要作用与control组相比,MG及HG组H9c2细胞ROS生成增多(p<0.01)。同时,MG及HG组NF-kBp65磷酸化及TXNIP表达较control组增多(p<0.01)。利用NAC预处理细胞能够明显减少细胞内ROS产生(p<0.01)。随着ROS的生成减少,NF-kBp65磷酸化及TXNIP表达减少,同时NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspasep20及IL-1βp17的表达降低(p<0.01)。研究结论(1)糖尿病状态下,心肌细胞焦亡及心肌纤维化促进心脏结构和功能异常；(2)在糖尿病早期,心肌组织NLRP3炎症小体即表达升高；(3)利用NLRP3-miRNA慢病毒实施体内干预后,心肌组织NLRP3的表达被有效抑制；(4)抑制心肌组织NLRP3表达后,糖尿病引起的心肌结构和功能的异常明显改善；(5)高糖刺激可诱导心肌细胞ROS生成增多,ROS可促进NLRP3炎症小体表达升高,增高的caspase-1可促进心肌细胞出现细胞焦亡的特征；(6)NF-kB及TXNIP可能介导了ROS促进NLRP3炎症小体表达增多。研究背景糖尿病性心肌病(diabeticcardiomyopathy,DCM)是以舒张功能显著受损和收缩功能轻度下降为特征的心肌病变,是糖尿病病人的主要死亡原因之一。既往研究表明,炎症反应在DCM中发挥着重要作用。因此,对DCM中炎症反应的相关调控机制进行深入研究并寻找相关治疗策略具有重要意义。促炎因子白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)在DCM的发病过程中起到非常重要的作用。既往研究表明,IL-1β的激活主要受炎症小体(inflammasome)调控。炎症小体是位于细胞内的一种多聚蛋白复合体,其家族成员包括：NLRs(nucleotidebindingoligomerizationdomain-likereceptors)家族及AIM2(absentinmelanoma2)家族。NLRP3(NODlikereceptorprotein3,NLRP3)是NLRs亚组中的一员。NLRP3炎症小体由NLRP3,含CARD结构域的凋亡相关颗粒样蛋白(apoptosis-associatedspeck-likeproteincontainingCARD,ASC)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(?)(cysteinylaspartatespecificproteinase-1,caspase-1)组成。近来有研究表明,NLRP3炎症小体在糖尿病、糖尿病肾病及糖尿病视网膜病变等疾病的炎症反应中起到非常重要的作用。此外,在高糖诱导的氧化应激反应中,NLRP3炎症小体通过与硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxininteracting/inhibitingprotein,TXNIP)直接结合而被激活,继而促发下游的炎症反应。我们前期的实验结果表明,NLRP3炎症小体通过促进炎症反应、心肌损伤及心肌纤维化而加速DCM的发生和发展。既往研究表明丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases,MAPKs)在DCM的炎症反应中发挥着重要作用。瑞舒伐他汀是一种HMG-CoA还原酶抑制剂。研究显示,瑞舒伐他汀除了具有调脂作用外,还具有抗炎、抗氧化及逆转心肌重构的作用。在心肌肥厚、心肌梗死及实验性自身免疫性心肌炎的动物模型中,瑞舒伐他汀的心脏保护作用已经得到证实。但是,具有抗炎作用的瑞舒伐他汀能否影响DCM中异常表达的NLRP3炎症小体及MAPKs通路,目前尚未见报道。瑞舒伐他汀能否通过NLRP3炎症小体及MAPKs通路改善心肌重构,目前尚未见报道。据此,本课题拟构建DCM大鼠模型,并研究瑞舒伐他汀在DCM发生、发展中的作用,探讨瑞舒伐他汀是否通过调控NLRP3炎症小体及MAPKs通路发挥心肌保护作用,进一步研究NLRP3炎症小体在DCM中潜在临床价值。研究目的(1)建立DCM大鼠模型,探讨RSV在DCM进展中的作用；(2)探讨NLRP3炎症小体及MAPKs通路在RSV对DCM大鼠心肌保护过程中的作用；(3)探讨RSV抑制NLRP3炎症小体的可能机制。研究方法2型糖尿病大鼠模型选择105只健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(山东省中医药大学实验动物中心),平均体重为100-120g。将大鼠随机分为7组：对照组(control组),高脂饮食组(HF组),糖尿病组(DM组),高脂饮食+瑞舒伐他汀10mg/kg组(HF+RSV10mg/kg组),高脂饮食+瑞舒伐他汀15mg/kg组(HF+RSV15mg/kg组),糖尿病+瑞舒伐他汀10mg/kg组(DM+RSV10mg/kg组),糖尿病+瑞舒伐他汀15mg/kg组(DM+RSV15mg/kg组)。Control组给予基础饲料喂养,主要成分为：5%脂质,不添加胆固醇。其余6组给予高脂饮食喂养,主要成分为：16%脂质,0.25%胆固醇。4周后7组大鼠均行腹腔葡萄糖耐量实验(IPGTT)及腹腔胰岛素耐量实验(IPITT)。DM组、DM+RSV10mg/kg组及DM+RSV15mg/kg组出现胰岛素抵抗的大鼠接受单次腹腔STZ注射,剂量为35mg/kg。1周后,检测DM组、DM+RSVlOmg/kg组及DM+RSV15mg/kg组大鼠的空腹血糖(BG)及胰岛素(INS),计算胰岛素敏感指数(ISI),ISI=In[INS×BG)-1]连续两次空腹血糖≥11.1mmol/L,且存在胰岛素抵抗则认为2型糖尿病造模成功。在行STZ腹腔注射8周后,HF+RSV10mg/kg组、HF+RSV15mg/kg、DM+RSV10mg/kg组及DM+RSV15mg/kg分别给予瑞舒伐他汀干预8周。瑞舒伐他汀干预8周后,7组大鼠均实施安乐死。糖尿病性心肌病模型糖尿病大鼠造模成功后,继续给予高脂喂养。至STZ注射后8周,检测大鼠心功能,糖尿病大鼠出现左室舒张功能障碍则提示开始进展为DCM。至STZ注射后16周,检测大鼠心脏结构及功能,糖尿病大鼠心脏组织呈现心肌间质纤维化及左室肥厚的,并出现左室收缩及舒张功能障碍,则提示DCM模型已经成功建立。基因沉默技术根据RNAi干扰技术的原则,设计4对针对大鼠NLRP3基因的miRNA片段,并分别构建4对pcDNA6.2-GW/EmGFP-NLRP3-miRNA质粒,经筛选后,选择沉默效率最高的质粒,随后构建pDONR221-EmGFP-NLRP3-miRNA重组穿梭质粒,最终构建pLenti6.3-EmGFP-NLRP3-miRNA慢病毒载体。大鼠体内转染慢病毒载体选择90只健康雄性SD大鼠(山东省中医药大学实验动物中心),平均体重为100-120g。将大鼠随机分为6组：对照组+空载体组(control+vehicle组),糖尿病组+空载体组(DM+vehicle组),糖尿病+瑞舒伐他汀15mg/kg+空载体组(DM+RSV15mg/kg+vehicle组),对照组+NLRP3-miRNA慢病毒干扰组(control+NLRP3-miRNA组),糖尿病组+NLRP3-miRNA慢病毒干扰组(DM+NLRP3-miRNA组),糖尿病+瑞舒伐他汀15mg/kg+NLRP3-miRNA慢病毒干扰组(DM+RSV15mg/kg+NLRP3-miRNA组)。于STZ注射8周后,分别给予6组大鼠vehicle或NLRP3-miRNA慢病毒行体内干预,同时还需给予DM+RSV15mg/kg+vehicle组及DM+RSV15mg/kg+NLRP3-miRNA组大鼠瑞舒伐他汀干预,慢病毒及瑞舒伐他汀的干预时间均为8周,慢病毒注射剂量为1×108TU/只。干预8周后给予大鼠安乐死,心脏取材后行冰冻切片,检测心肌内病毒转染效率。血清学指标检测于实验结束时,行血清学检测。大鼠禁食禁水12小时后,取外周静脉血。检测血糖(bloodglucose,BG)、血清甘油三酯(triglyceride,TG)、总胆固醇(totalcholesterol,TC)、胰岛素(INS),并计算胰岛素敏感指数(ISI)。心脏彩超大鼠经10%水合氯醛麻醉后,行经胸心脏彩超,收集LVEF、F/S、E/A以及E’/A’等数据评价大鼠左室功能。心肌纤维化对左室心肌组织行Masson染色、天狼猩红染色,使用图像分析软件对染色结果进行分析,评价左室心肌纤维化程度。透谢电镜大鼠行安乐死后,立即心脏取材,于左室壁上取1mm3小组织块,立即放入戊二醛固定液中,为透射电镜下观察左室心肌超微结构做准备。实时定量PCR取新鲜左室心肌组织,通过实时定量荧光PCR技术检测TXNIP、NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β、collagenI及collagenIII的mRNA相对表达量。Westernblot检测取新鲜左室心肌组织,提取蛋白,利用Westernblot检测心肌组织内TXNIIP、NLRP3、ASC、活化与非活化的caspase-1、活化的IL-1β及磷酸化和非磷酸化的ERK1/2、p38.JNK的蛋白表达量。统计学分析利用SPSSv18.0处理数据,连续变量以均数±标准误来表示。利用单因素方差分析和Tukey-Kramerposthoc检验比较多组间的连续型变量。利用独立样本t检验比较两组间的连续变量。当p<0.05时认为有统计学意义。研究结果高脂饮食4周可诱导大鼠出现胰岛素抵抗IPGTT结果显示,与基础饮食相比,高脂喂养大鼠4周后,在IPGTT的0min、30min、60min、120min的血糖值均明显升高(p<0.05～p<0.01)；血糖曲线下面积(AUC)明显增大(p<0.01)。IPITT的结果显示,与基础饮食相比,高脂喂养大鼠4周后,在IPITT的Omin、30min、60min、120min的血糖值均明显升高(p<0.05～p<0.01)；血糖曲线下面积(AUC)明显增大(p<0.01)。瑞舒伐他汀对糖尿病大鼠血糖及胰岛素水平无明显影响与Control及HF组大鼠相比,DM组大鼠表现出高血糖、高血脂、低胰岛素水平及胰岛素敏感性指数下降等特点(p<0.01)。与Control组比较,HF也存在代谢异常的情况(p<0.05～p<0.01)。与未治疗组相比,10mg/kg及15mg/kg瑞舒伐他汀均能降低DM及HF组的胆固醇水平(p<0.05),且15mg/kg瑞舒伐他汀降脂效果优于10mg/kg(p<0.05)。与未用药组相比,10mg/kg或15mg/kg的瑞舒伐他汀均未能逆转DM组及HF组出现的血糖、甘油三酯及胰岛素异常。瑞舒伐他汀改善糖尿病引起的左室功能异常DM组的LVEF、FS、E/A及E’/A’均低于Control组,HF组的E/A及E’/A’均低于Control组(p<0.05～p<0.01)。与未治疗组相比,15mg/kg瑞舒伐他汀可以提高DM组的LVEF、E/A及E’/A’(p<0.05)。10mg/kg瑞舒伐他汀可提高DM组的E’/A’(p<0.05)。瑞舒伐他汀改善糖尿病引起的心肌重构与Control组相比,DM组及HF组的心身比(heartweighttobodyweight,HW/BW)均增加(p<0.05～p<0.01)。糖尿病诱导心肌间质纤维化,促进胶原I及胶原Ⅲ的(?)nRNA表达增加,促进胶原Ⅰ/Ⅲ的增大。与Control组相比,HF组也呈现心肌纤维化增多、胶原(?)nRNA表达增加的现象(p<0.05-p<0.01)。Control组大鼠左室心肌组织透射电镜结果显示：心肌纤维成对称性分布,Z线有序排列在肌节周围,线粒体规则分布在肌纤维附近。DM组电镜结果显示：心肌超微结构混乱无序,部分区域心肌纤维溶解,Z线退化,线粒体肿胀并出现空泡化,线粒体聚集、融合、内部线粒体嵴混乱。HF组电镜结果显示左室心肌组织超微结构亦出现破坏,但破坏程度较DM组轻。与未治疗组相比,15mg/kg瑞舒伐他汀可降低DM组的HW/BW、左室纤维化面积、胶原Ⅰ/Ⅲ的表达量及比例的异常(p<0.01)。10mg/kg瑞舒伐他汀仅能改善心肌纤维化及胶原Ⅰ的表达异常(p<0.05～p<0.01)。但与未治疗组相比,瑞舒伐他汀未能有效改善HF组HW/BW及胶原Ⅰ及Ⅲ的表达量及比例异常。电镜结果显示,经瑞舒伐他汀干预后,DM组及HF组的左心室心肌组织超微结构较未治疗组有明显改善。瑞舒伐他汀抑制炎症小体激活我们检测不同组别大鼠左室心肌组织中TXNIP、NLRP3、ASC、未活化及活化的caspase-1(pro-caspase-1,caspase-1p20)及IL-1β(IL-1β,IL-1βp17)的mRNA及蛋白的表达水平。DM组中TXNIP、NLRP3、ASC、caspase-1及IL-1p的mRNA表达水平均高于control组(p<0.01)。DM组TXNIP、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1p20及IL-1βp17蛋白表达水平均高于control组(p<0.05～p<0.01)。与control组相比,HF组的TXNIP、NLRP3炎症小体及IL-1β的mRNA及蛋白表达量明显增高(p<0.05～p<0.01)。与未治疗组比较,15mg/kg瑞舒伐他汀可降低糖尿病引起的TXNIP、NLRP3炎症小体及IL-1β的mRNA表达(p<0.05-p<0.01)。10mg/kg瑞舒伐他汀也可明显降低TXNIP及IL-1β的mRNA表达水平。与未治疗组比较,瑞舒伐他汀降低了HF组TXNIP、NLRP3、ASC及IL-1p的mRNA表达水平(p<0.05～p<0.01)。与未治疗组相比,15mg/kg瑞舒伐他汀降低糖尿病引起的TXNIP.NLRP3炎症小体、ⅠL-1βp17蛋白表达升高(p<0.05-p<0.01).10mg/kg瑞舒伐他汀只降低糖尿病引起的pro-caspase-1蛋白表达升高(p<0.05)。此外,15mg/kg瑞舒伐他汀的对TXNIP、ASC、pro-caspase-1、caspase-1p20及IL-1βp17蛋白表达的抑制效果优于10mg/kg(p<0.01)。对HF组进行相同干预,观察到类似结果。瑞舒伐他汀抑制MAPK信号通路我们检测不同组别大鼠左室心肌组织中磷酸化及未磷酸化的ERK1/2,p38及JNK的表达水平。与对照组相比,DM及HF组中磷酸化的ERK1/2,p38及JNK表达升高(p<0.05-p<0.01)。与未治疗组比较,10mg/kg及15mg/kg均能降低DM组磷酸化的ERK1/2,p38及JNK(p<0.05-p<0.01)。此外,15mg/kg瑞舒伐他汀抑制磷酸化的ERK1/2的作用优于10mg/kg瑞舒伐他汀。在瑞舒伐他汀干预的HF组中也发现了类似结果(p<0.05～p<0.01)。检测体内传染后NLRP3沉默效率行NLRP3-miRNA慢病毒体内转染8周后,检测心肌组织转染效率。与转染空载体组相比,转染NLRP3-miRNA’慢病毒组可明显抑制大鼠心肌组织中NLRP3的mRNA及蛋白水平的表达。此外,随着NLRP3表达的降低,IL-1βp17的表达也降低(p<0.05～p<0.01)。瑞舒伐他汀通过抑制NLRP3改善糖尿病引起的心功能损害进行8周的病毒干预后,与空载体组相比,NLRP3-miRNA干预组能显著改善糖尿病引起的LVEF、FS、E/A及E’/A’降低(p<0.05)。此外,与空载体组相比,NLRP3-miRNA干预组能显著提高DM+RSV15mg/kg组的E/A及E’/A’(p<0.05)。在空载体转染的糖尿病大鼠中,给予瑞舒伐他汀干预能明显改善心脏的收缩及舒张功能(p<0.05)。但与空载体组相比,NLRP3-miRNA干预组中瑞舒伐他汀的这种心脏保护作用并不明显。瑞舒伐他汀通过抑制NLRP3减轻心肌损伤与空载体组相比,NLRP3-miRNA可以降低DM组的心身比、间质纤维化、胶原Ⅰ及Ⅲ的(?)nRNA表达及比例(p<0.05-p<0.01)。NLRP3-miRNA还能显著改善心肌超微结构的损伤,包括逆转降解的Z线、紊乱的心肌纤维、肿胀的线粒体及积聚的脂肪微粒。与空载体联合15mg/kg瑞舒伐他汀相比,NLRP3-miRNA联合15mg/kg瑞舒伐他汀能更显著地改善糖尿病引起的心脏结构和功能的改变(p<0.05～p<0.01)。瑞舒伐他汀的心肌保护作用在空载体干预组中非常明显,但这种保护作用在NLRP3-miRNA干预组中并不明显。研究结论(1)NLRP3炎症小体介导了瑞舒伐他汀对DCM的心脏保护作用；MAPKs通路可能参与了瑞舒伐他汀对DCM的心脏保护作用；(2)长期给予瑞舒伐他汀干预可剂量依赖性地改善糖尿病性心肌病左室重构及收缩和舒张功能障碍；(3)瑞舒伐他汀的心肌保护作用包括：抑制心肌炎症反应；减轻心肌细胞的肌纤维紊乱、Z线降解、线粒体肿胀融合及脂质沉积等超微结构的破坏；抑制胶原纤维的产生及沉积；(4)TXNIP可能介导了瑞舒伐他汀抑制NLRP3炎症小体的作用。研究背景原发性扩张型心肌病(idiopathicdilatedcardiomyopathy,IDCM)是一种病因不明,以心肌受累为基础,以心室扩张及收缩功能受损为特点的疾病。IDCM是继冠状动脉疾病及高血压疾病之后,引起心功能衰竭的第三大常见疾病。临床资料显示,IDCM患者通常需要反复住院治疗,部分患者预后不良。流行病学资料显示,IDCM的治疗已经成为公共卫生医疗系统的负担。因此,寻找与IDCM预后相关、并能提供干预预警信号及临床治疗靶点的因子,已经成为目前研究的热点。虽然IDCM的病因不明,但研究显示病毒感染、炎症、自身免疫异常及基因突变均能促进IDCM的发生及发展。其中,炎症反应在IDCM的病理生理过程中发挥重要作用。白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)是一种重要的促炎因子,其在多种心血管疾病中均表达上调。研究显示,IL-1β的成熟主要受炎症小体调控。炎症小体是一种蛋白复合物,主要位于细胞质内,其家族成员主要包括NLRs(nucleotidebindingoligomerizationdomain-likereceptors)家族及AIM2(absentinmelanoma2)家族。NLRP3(NODlikereceptorprotein3)是NLRs亚组中的一员。NLRP3炎症小体由NLRP3、含CARD结构域的凋亡相关颗粒样蛋白(apoptosis-associatedspeck-likeproteincontainingCARD,ASC)及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(cysteinylaspartatespecificproteinase-1,caspase-1)组成。当NLRP3炎症小体在相关信号的刺激下形成复合物之后,pro-caspase-1将会自我剪切,最终具有活性的caspase-1p10/p20蛋白,活化的caspase-1又可促进IL-1β从非活性的前体pro-IL-1β转化成具有活性的IL-1β。外周血单核淋巴细胞(peripheralbloodmononuclearcells,PBMCs)是血液循环中NLRP3炎症小体的主要来源。在系统性红斑狼疮、风湿性关节炎及系统性硬化等疾病中,PBMCs中NLRP3炎症小体的异常表达在疾病病程中起到重要的作用。近期的研究显示,NLRP3炎症小体在心肌缺血再灌注、急性心肌梗死及心衰等动物模型中表达上调,并促进心肌炎症损伤及纤维化,最终导致心功能异常。我们的前期结果表明,NLRP3炎症小体在糖尿病性心肌病中发挥重要作用。这些研究提NLRP3炎症小体的异常激活与心血管疾病密切相关,PBMCs中NLRP3炎症小体的异常激活在疾病的发展过程中具有重大意义。但目前,IDCM患者PBMCs中NLRP3炎症小体的表达尚未见报道。据此,本实验将检测IDCM患者PBMCs中NLRP3炎症小体的表达水平,并探究IDCM患者体内NLRP3炎症小体表达水平与患者预后的相关性。研究目的(1)探究NLRP3炎症小体在IDCM患者PBMCs中的表达水平；(2)探究NLRP3炎症小体与IDCM患者临床指标的相关性；(3)探究NLRP3炎症小体在IDCM患者预后评估中的价值。研究方法研究对象连续收录就诊于山东大学齐鲁医院的IDCM患者54人(IDCM组),收录健康志愿者20人(Control组)。IDCM患者同时患有以下疾病者不能纳入实验：活动期的心肌炎、冠脉疾病、心脏瓣膜病、高血压、急性或慢性炎症性疾病、糖尿病、甲状腺功能异常、痛风及类风湿性关节炎。在患者入院及健康志愿者入组时开始收集临床资料,主要包括：年龄、性别、血压、12导联心电图(12-leadelectrocardiography,ECG)、心脏彩超检查结果、纽约心功能分级(NewYorkHeartAssociation,NYHA)、血常规检查结果、血清N末端B型脑钠肽(N-terminalpro-brainnatriureticpeptide,NT-proBNP)检查结果等。IDCM患者住院期间均得到规范治疗。本实验设计已通过山东大学齐鲁医院伦理委员会审核。PBMCs分离和纯化收集研究对象的外周血,并分离出血清及PBMCs,分别存于-80℃备用。实时定量PCR利用实时定量方法检测研究对象PBMCs中NLRP3、ASC、caspase-1及IL-1β的mRNA表达水平。流式细胞术分别利用固定剂和打孔剂处理PBMCs,随后分别使用NLRP3特异性一抗及带有FITC的二抗孵育PBMCs,处理完毕后利用流式细胞术检测PBMCs胞浆中NLRP3的蛋白表达水平。Westernblot从研究对象PBMCs中提取蛋白,利用westernblot方法检测ASC、pro-caspase-1及活化的caspase-1的蛋白表达。酶联免疫反应(Enzyme-linkedimmunosobentassay,ELISA)利用ELISA检测研究对象外周血血清中IL-1β的含量。随访IDCM患者从山东大学齐鲁医院出院后,将患者因心功能恶化而再入院定为终点事件,对患者进行为期6个月的随访,并记录IDCM患者的再入院的时间。统计分析SPSS18.0用于统计分析PASS用于效能计算。连续变量以均数±标准差的形式表示,分类变量以百分数形式表示。t检验用于两组连续变量间统计分析。方差分析用于多组连续变量间统计分析。卡方检验用于分类变量统计分析。偏相关分析用于目标因子与临床指标相关性的统计分析。Cox回归分析用于IDCM患者6个月内再入院的影响因素的统计分析。Kaplan-Meier法用于2组IDCM患者6个月再入院率的统计分析,并绘制时间-效应曲线Log-rank检验用于比较2组IDCM患者6个月再入院率的比较。双侧p<0.05时认为有统计学意义。研究结果研究对象基本信息IDCM组及Control组的临床资料如表1所示。在所研究的参数中,仅左室射血分数(leftventricularejectionfarction,LVEF)(p<0.001)、NT-proBNP(p<0.001)及外周血单核细胞计数(p=0.008)在IDCM组及control组中存在统计学差异。NLRP3炎症小体及IL-1β在IDCM患者PBMCs中表达上调入院24小时内,在未进行治疗干预前,IDCM组PBMCs中NLRP3炎症小体及IL-1βmRNA表达水平较control组明显升高(3.50±2.02vs.0.90±0.27,3.54±1.90vs.0.80±0.22,3.82±2.79vs.0.88±0.11,3.96士2.21vs.0.73±0.25,p<0.001)。在IDCM组中,出院时NLRP3.ASC.caspase-1及IL-1β的mRNA水平较入院时降低(1.74±1.20vs.3.50±2.02,1.81±1.17vs.3.54±1.90,2.19±1.53vs.3.82±2.79,2.20±1.23vs.3.96±2.21,p<0.001),但仍高于control组(1.74±1.20vs.0.90±0.27,p<0.05;1.81±1.17vs.0.80±0.22,p<0.01；2.19±1.53vs.0.88±0.11,p<0.01;2.20±1.23vs.0.73±0.25,p<0.05).入院24小时内,在未进行治疗干预前,IDCM组PBMCs中NLRP3.ASC.pro-caspase-1.caspase-1蛋白表达水平及血清中IL-1p蛋白表达水平较control组明显升高(p<0.01)。在IDCM组中,出院时NLRP3.ASC.caspase-1及IL-1p的蛋白水平较入院时均降低(p<0.01),但仍高于control组(p<0.01)。在IDCM组中,PBMCs中pro-caspase-1蛋白表达在入院时和出院时的表达水平未见明显差异。IDCM患者NLRP3炎症小体的表达水平与临床参数相关入院时,剔除了年龄、性别等影响因素后,IDCM组PBMCs中NLRP3的mRNA水平与LVEF(r=-0.520,p<0.05).单核细胞数(r=0.613,p<0.05)及NT-proBNP水平(r==0.514,p<0.05)相关。IDCM组PBMCs中ASC的mRNA水平仅与LVEF(r=-0.334,p<0.05)及单核细胞数(r=0.592,p<0.05)相关。NLRP3mRNA表达水平是IDCM患者6个月内再入院的独立危险因素将IDCM患者出院时的LVEF及NLRP3.ASC.pro-caspase-1及IL-1β的mRNA表达水平纳入Cox多因素回归分析模型,结果显示：LVEF(RR:0.001,95%置信区间：0.000-0.128,p<0.001),NLRP3mRNA水平(RR:1.643,95%置信区间：1.193-2.264,p=0.002),IL-1pmRNA水平(RR：1.512,95%置信区间：1.131-2.031,p=0.032)是IDCM患者6个月内再入院的独立危险因素。NLRP3mRNA表达水平与IDCM预后相关在IDCM患者中,出院时NLRP3mRNA表达量低的患者再入院的风险低于NLRP3mRNA表达水平高的患者(p<0.05)。研究结论(1)NLRP3炎症小体在IDCM患者PBMCs中表达上调；(2)IDCM患者NLRP3及ASCmRNA表达水平与心功能相关；(3)IDCM患者中,NLRP3mRNA高表达可提示患者半年再入院风险增加。
【作者】罗蓓蓓；
【导师】安丰双；
【作者基本信息】山东大学，内科学（专业学位），2014，博士
【关键词】糖尿病性心肌病；NLRP3炎症小体；细胞焦亡；活性氧；瑞舒伐他汀；炎症反应；丝裂原活化蛋白激酶；原发性扩张型心肌病；外周血单核淋巴细胞；再入院率；

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