胎盘间充质干细胞对小鼠特应性皮炎样模型的影响及机制探讨

【摘要】目的：(1)分离培养人胎盘间充质干细胞(placentamesenchymalstemcells，PMSCs)备用；(2)建立特应性皮炎(atopicdermatitis，AD)样动物模型；(3)探讨PMSCs对小鼠AD样皮损的影响；(4)探讨PMSCs对AD样动物模型引流淋巴结和脾脏中Foxp3+Treg数量的影响；(5)PMSCs在小鼠AD样模型中对皮损IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF、IFN-γ的影响及机制。方法：(1)PMSCs分离用组织块法联合酶消化法，鉴定采用流式细胞仪检测细胞表面分子，体外诱导其分化成脂肪细胞、成骨细胞和成软骨细胞；(2)用1%5-异硫氰酸荧光素(Fluoresceinisothiocyanate，FITC)诱发BALB/c小鼠建立急性(激发1次)和慢性(每3d激发1次，共7次)AD样模型；(3)静脉注射不同剂量的PMSCs(0.5×106，1×106或2×106个/次/只)治疗小鼠急(1次)、慢性(2次)AD样模型，肉眼观察小鼠耳朵和背部皮肤的变化，动态测量小鼠耳厚度，处死前称重，处死后称其耳和脾脏重量，计算左右耳的重量差以及脾脏指数；(4)用流式细胞术检测小鼠脾脏及耳部引流淋巴结的Foxp3+Treg细胞；(5)用流式细胞仪微球捕获芯片技术法(CBA)检测小鼠背部皮肤组织匀浆中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF、IFN-γ含量；(6)小鼠耳朵和背部皮肤进行常规组织病理切片和HE染色，光镜下观察其皮肤病理改变，并计算表皮层数和真皮中的炎症细胞数。结果：（一）成功分离、鉴定、扩增PMSCsPMSCs表面表达CD29、CD90、CD105，CD34、CD45、HLA-DR为阴性，PMSCs体外诱导可分化为成脂肪细胞、成骨细胞和成软骨细胞。（二）成功建立小鼠AD样模型(1)急性AD样模型激发前左耳厚度(24.90±0.89)×10-3mm，激发12h后耳廓和背部皮肤可见轻度水肿性红斑，24h后厚度达到(28.00±1.06)×10-3mm，48h时达高峰(28.70±0.67)×10-3mm，此时左耳重量为(13.88±0.61)mg，左右耳的重量差为(0.84±0.72)mg。耳和背部皮肤的组织病理变化类似急性皮炎，表现为表皮轻微水肿和增厚，真皮浅层水肿，小血管扩张，较多的炎症细胞浸润(主要是单一核细胞和少许多形核细胞)，与基质组比较，耳和背部的浸润细胞数增多(P<0.05)、背部的表皮层数增多(P<0.05)。模型组小鼠皮损中Th1、Th2细胞因子均升高，IFN-γ/IL-4比值比基质组下降，此小鼠中出现以Th2占优势的Thl/Th2的平衡失调。(2)慢性AD样模型第1次激发前左耳厚度(27.00±1.27)×10-3mm，第1次激发12h后即出现轻度水肿性红斑，随着激发次数的增多，水肿性红斑逐渐加重，并可见渗出结痂、鳞屑和毛发脱落(主要见于背部)，第28d(处死前)耳厚度为(39.30±4.15)×10-3mm，左耳重量为(19.60±3.86)mg，左右耳的重量差为(5.24±3.26)mg。光镜下皮肤呈亚急性和慢性皮炎样改变：耳部皮肤可见表皮角质层较明显增厚，偶见血清痂，棘层增厚(4～5层)，真皮内有大量的细胞浸润(主要是单一核细胞和少许多形核细胞)；背部皮肤表现为表皮显著角化过度，角化不全，棘层明显增厚(6～8层)，有细胞外移，偶见血清痂，真皮内有大量炎症细胞浸润(主要是单一核细胞)，与基质组相比，浸润细胞数和棘层层数均明显增多(P<0.05~0.01)。模型组小鼠皮损中IFN-γ/IL-4比值仍低于基质组，Th2占优势的Thl/Th2的平衡失调依然存在。（三）PMSCs对小鼠AD样模型的影响(1)急性小鼠AD样模型激发后24h时，PMSCs注射的高剂量组小鼠耳厚低于模型组(P<0.05)，中剂量组亦小于模型组，但差异无显著性(P＞0.05)，48h时，中、高剂量组的耳厚度小于模型组(P<0.05)。其效果与剂量呈正相关；PMSCs中、高剂量组的耳重量小于模型组，但无统计学意义(P>0.05)。在组织病理片上，中、高剂量组耳和背部皮肤中的真皮浸润细胞数和背部表皮的层数均低于模型组(P均<0.05)，表明PMSCs对急性AD样皮损有治疗作用；(2)慢性小鼠AD样模型PMSCs高剂量组在激发1d后与模型组相比耳厚度小于模型组(P<0.05)，在4d后中、高剂量组耳的厚度均小于模型组(P<0.05)，且高剂量的疗效好于低剂量组；PMSCs各剂量组耳重量均轻于模型组，但无显著性差异(P>0.05)。组织病理学方面，高剂量组的耳和背部皮肤真皮中浸润细胞数以及背部的表皮厚度小于模型组(P<0.05)，中剂量组的浸润细胞数亦低于模型组(P<0.05)；此外，高剂量组真皮内的浸润细胞数和背部表皮的厚度小于中剂量组(P均<0.05)，说明PMSCs对慢性小鼠AD样皮损亦有治疗作用，且其疗效与细胞浓度有关。(四)PMSCs对小鼠AD样模型中Foxp3+Treg细胞数量的影响中、高剂量PMSCs可促进AD样小鼠急性期引流淋巴结中Foxp3+Treg的生成，对脾脏中Foxp3+Treg细胞数未见明显影响。(五)各组小鼠皮损中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF和IFN-γ的变化(1)与急性基质对照组相比，急性模型组皮损中Th2型细胞因子IL-4、IL-6、IL-10水平显著升高，Th1型细胞因子IL-2升高、IFN-γ无明显变化，炎性因子TNF显著升高，Th17细胞特异性标志IL-17A显著升高(P<0.05)，模型组IFN-γ/IL-4(1.32±0.76)低于基质组(2.11±0.86)，提示该模型是由Th2型免疫反应所致。(2)与慢性基质对照组相比，慢性模型组皮损中Th2型细胞因子IL-4、IL-6、IL-10水平升高，Th1型细胞因子IFN-γ轻度升高、IL-2无明显变化，炎性因子TNF显著升高，Th17细胞特异性标志IL-17A无明显改变，慢性组IFN-γ/IL-4(0.73±0.64)小于基质组(1.34±0.41)，提示该慢性模型组亦是以Th2型免疫反应为主。(3)地塞米松对小鼠AD样模型治疗的作用机制地塞米松可显著抑制急性小鼠AD样模型皮损中IL-2、IL-4水平，轻微减少TNF、IFN-γ的产生，对IL-6、IL-10无明显影响，使IFN-γ/IL-4(2.76±3.53)升高，使皮损中的炎性因子TNF减少以及IL-17A下降，表明地塞米松可以通过调控Th1/Th2细胞的失衡来减轻皮损炎症。(4)PMSCs对小鼠AD样模型治疗的作用机制①与急性模型组比较，低、中剂量PMSCs引起小鼠急性AD样模型皮肤中Th2细胞因子IL-6、IL-10明显下降，中剂量组中IL-4下降，低剂量组中IL-4无明显改变，而高剂量组致使皮损中的IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ、IL-17A升高；使低、中剂量组的IFN-γ/IL-4(0.86±0.28、0.97±0.22)减少，高剂量组的(2.12±1.55)升高，并趋于正常，提示PMSCs对Th1、Th2、Th17的影响随着浓度的高低可能具有双向调节作用，且与细胞浓度相关。②与慢性模型组比较，PMSCs可使皮损中的IL-10和TNF减少，但对其他因子无明显影响。结论：(1)成功分离PMSCs；(2)用1%FITC诱导BALB/c小鼠成功建立以Th2型免疫反应为主的急、慢性AD样模型；(3)静脉给予PMSCs可减轻小鼠急、慢性AD样皮肤炎症，且疗效与剂量有关，其机制可能是通过调控Th1/Th2、Treg/Th17细胞失衡发挥治疗作用。
【作者】余珊珊；
【导师】陈爱明；
【作者基本信息】苏州大学，皮肤病与性病学，2014，硕士
【关键词】胎盘间充质干细胞；特应性皮炎样动物模型；BALB/c小鼠；Foxp3+Treg；IL-2；IL-4；IL-6；IL-10；IL-17A；TNF；IFN-γ；

【参考文献】
[1]赵凯旋.X_(cJ)→K*(892)~0(K|-)*(892)~0衰变的实验过程研究[D].南京师范大学,粒子物理与原子核物理,2012,硕士.
[2]卢金秋,叶枫.基于BP神经网络的海关企业风险评估研究与应用[J].计算机应用,2005,S1:333-335+338.
[3]黄露.山地宅居区域景观空间研究[D].南昌大学,设计艺术学,2012,硕士.
[4]彭真.高温影响番茄花粉发育的细胞学研究及花药差异表达分析[D].浙江大学,蔬菜学,2012,硕士.
[5]潘婧文.近代皖籍名人蔡晓舟研究[D].安徽大学,中国史,2013,硕士.
[6]郑德根.基于激光超声的铝合金搅拌摩擦焊缺陷评价[D].上海交通大学,材料科学与工程,2014,硕士.
[7]常龙.资产价格波动对实体经济影响的传导机制研究[D].南京财经大学,西方经济学,2013,硕士.
[8]闫静静.新形势下我国廉政文化建设研究[D].东北大学,马克思主义中国化研究,2009,硕士.
[9]温海英.长山大桥主桥三维仿真分析[D].大连海事大学,交通运输工程,2013,硕士.
[10]张美兰.教学目标呈现策略对教学效果影响的实验研究[D].江西师范大学,基础心理学,2004,硕士.
[11]徐西江.利益衡量在我国司法实践中的运用[D].上海大学,法律,2014,硕士.
[12]高金曼.河北大学来华留学生跨文化适应状况调查研究[D].河北大学,汉语国际教育（专业学位）,2014,硕士.
[13]张征兵.铜山口铜矿人力资源规划研究[D].西安工业大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[14]李英林.当代大学生道德人格的文化塑造[D].东北师范大学,马克思主义理论与思想政治教育,2003,硕士.
[15]程龙.节能服务公司合同能源管理融资研究[D].山东财经大学,技术经济及管理,2013,硕士.
[16]刘扬扬.新型中速机油中烷基水杨酸盐型复合剂的组成和作用研究[D].华东理工大学,化学工艺,2014,硕士.
[17]于淼.运用探究式教学提高学生阅读训练中的自主学习能力[D].长春师范大学,课程与教学论,2013,硕士.
[18]付慧文.多数据库挖掘的若干问题研究[D].广西师范大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[19]朱正伟.交通基础设施与中国制造业库存水平的关系研究[D].重庆大学,产业经济学,2014,硕士.
[20]侯璞.信息披露质量与公司财务状况关系研究[D].北京交通大学,2014.
[21]胡晶雅.俄语称呼语性别差异的社会语言学研究[D].大连海事大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[22]迟海燕.城市供水管网氯的优化配置[D].天津大学,环境工程,2004,硕士.
[23]冯灿.体育高职院校实行“导师制”教育管理的研究[D].湖南师范大学,体育人文社会学,2014,硕士.
[24]龚爱华.再生丝素膜细胞相容性和遗传毒性的研究[D].苏州大学,免疫学,2003,硕士.
[25]高军凯,顾平,张光辉,高鑫,侯立安.吸附法处理低浓度含铀废水的研究进展[J].中国工程科学,2014,07:73-78.
[26]胡希.基于DSSC光阳极二氧化钛的制备、改性及光电性能研究[D].中南大学,2011.
[27]孙细明,张晓鹏.基于信息熵的决策树算法实现[J].计算机与数字工程,2005,11:96-97+123.
[28]张剑楠.新型透明导电薄膜的研制及其在有机太阳能电池中的应用[D].中国科学院研究生院（长春光学精密机械与物理研究所）,凝聚态物理,2012,硕士.
[29]齐福柱.基于分形维数的磨粒识别方法研究[D].大连海事大学,船舶与海洋工程,2014,硕士.
[30]马慧麟,吴晓洁.关于大型企业数据仓库建设中的几个关键问题的研究[J].制造技术与机床,2005,05:92-94.
[31]刘长城.基于BIM理论的建筑能耗评估和分析[D].安徽建筑大学,市政工程,2013,硕士.
[32]李洁.大学生自我控制能力的培育研究[D].中国矿业大学,思想政治教育,2014,硕士.
[33]杜冬梅.钢铁常温锌铁系磷化及表面覆盖技术的研究[D].大连海事大学,环境科学,2004,硕士.
[34]陈浩,吴洁明.基于WebGIS的物流电子商务与配送网络优化集成[J].计算机与现代化,2005,03:89-92.
[35]宗有弟.GFY-1型辊缝仪鉴定会在张家口召开[J].冶金自动化,1980,06:57.
[36]胡序明.马立克氏病病毒RB1B株感染鸡的蛋白质组、转录组学及天然免疫机理研究[D].扬州大学,预防兽医学,2014,博士.
[37]陈宝厚.永葆开拓精神,再创新局面[J].石油地球物理勘探,1995,03:297-298.
[38]洪杨欢.基于智能计算的变权重组合优化短期负荷预测研究[D].广东工业大学,电气工程,2013,硕士.
[39]刘靓.加固轴压混凝土柱的有限元及可靠度分析[D].哈尔滨工业大学,建筑与土木工程,2013,硕士.
[40]孙曼璐.基于E-learning的培训系统的设计与实现[D].吉林大学,软件工程,2012,硕士.
[41]刘明君.基于混合交通流的信号交叉口机动车车头时距研究[D].北京交通大学,2010.
[42]杨友光.耦合腔半导体激光器研究[D].浙江大学,光通信技术,2013,硕士.
[43]许柯.基于悬架K&C特性的整车操纵稳定性优化[D].湖南大学,车辆工程,2014,硕士.
[44]邓克,李维兵.铁精矿铁品位与二氧化硅含量关系的研究[J].金属矿山.2004(03)
[45]郭庚麒.Web文本挖掘技术[J].计算机与网络,2004,Z1:114-116.
[46]混合系统课题组.数模混合系统及其在自动飞行控制系统仿真研究中的应用[J].自动化学报,1980,02:112-120.
[47]刘毅庆.广发银行五角场支行个金业务营销策略研究[D].兰州大学,营销管理（专业学位）,2014,硕士.
[48]王开红.多相催化剂催化强化电化学反应降解染料废水的研究[D].河北科技大学,环境工程,2013,硕士.
[49]唐国英.基于健康档案的区域卫生信息化平台设计与实现[D].湖南大学,电子与通信工程,2012,硕士.
[50]郭忠威.自发性肾破裂出血的诊治分析[D].吉林大学,临床医学,2014,硕士.