海洋假交替单胞菌适应海冰环境的机制及其遗传操作体系的建立

【摘要】假交替单胞菌广泛分布于海洋环境中,并且仅分布于海洋环境中。目前已从深海以及极地等众多海洋环境分离到假交替单胞菌。研究表明假交替单胞菌的适应机制和存活策略具有多样性和有效性,这使得它们能够广泛的生存于各种海洋环境中。假交替单胞菌是研究海洋微生物适应海洋特殊生境的重要模式菌,对假交替单胞菌环境适应机制的深入研究将有助于揭示生命适应不同海洋环境的能力。而且,由于其能产生很多活性物质和胞外酶类,假交替单胞菌也被认为是具有重要应用价值的一类细菌,本文首先以北极海冰假交替单胞菌为研究对象,首次从北极海冰假交替单胞菌中分离到丝状噬菌体,进而研究了丝状噬菌体对宿主菌在生长、耐受性及运动性等方面的影响及分子机制,揭示了丝状噬菌体介导的假交替单胞菌适应海冰环境的机制。然后建立了深海假交替单胞菌Pseudoalteromonassp.SM9913的高效接合转移体系,并在此基础上建立了Ps.sp.SM9913基因敲除体系,为深入研究假交替单胞菌适应深海环境的遗传机制奠定基础；建立了北极海冰假交替单胞菌Ps.sp.SM20429的接合转移体系及适冷异源表达体系,成功表达了在大肠杆菌表达体系中无法成熟表达的适冷金属蛋白酶,为深入研究该酶的催化机制及实现适冷酶的大量表达奠定基础。一、丝状噬菌体介导的假交替单胞菌适应海冰环境的机制研究表明,假交替单胞菌广泛地分布在北极海冰中,是北极海冰中的优势菌株。然而对这类菌株如何适应海冰环境还没有深入的研究。有研究表明海冰中的噬菌体可以通过裂解宿主细菌从而调控微生物群落的结构以适应海冰环境。然而作为不裂解宿主的丝状噬菌体,是否在海冰环境中存在,若存在又是如何调控微生物群落还不得而知。本文在实验室前期从北极海冰Ps.sp.BSi20327中分离的质粒pSM327的基础上,通过对其序列的详细分析,认为pSM327应是丝状噬菌体在宿主胞内的复制形式(RF)。从Ps.sp.BSi20327的培养液中提取并观察到了丝状噬菌体。并进而研究了丝状噬菌体的基本性质和在北极海冰假交替单胞菌中的分布。深入研究了其对宿主产生的影响及机制。取得了以下结果：(1)北极海冰假交替单胞菌丝状噬菌体f327的发现、基本性质及其分布的研究从Ps.sp.BSi20327的胞外提取并观察到了丝状噬菌体,将其命名为f327。f327呈细丝状,长约1.5μm,宽约14nm。详细分析了其基因组结构,f327基因组为单链DNA,全长包含6114个核苷酸,存在9个ORF。这些ORF编码的蛋白在序列相似性和排列的顺序上都与已发现的丝状噬菌体很相似。按编码的蛋白的功能划分,可将这9个ORF划分成四个模块：复制模块、结构模块、组装模块和调控模块。利用PCR扩增的方法,检测了f327在北极海冰假交替单胞菌中的分布情况,结果表明36%的菌株含有f327或其高度同源的丝状噬菌体。通过构建进化树以及DNA-DNA杂交分析,发现含丝状噬菌体的宿主属于假交替单胞菌的同一个种,说明f327或其高度同源的噬菌体广泛地分别于同一个种的假交替单胞菌中。如此广泛的分布说明f327可能会对宿主假交替单胞菌群落产生一定的影响,进而调控假交替单胞菌群落适应海冰环境的变化。(2)丝状噬菌体f327的生态学功能及其影响宿主假交替单胞菌的分子机制研究为了研究f327对宿主的影响,通过高温培养的方法消除了f327在宿主胞内的复制形式RF327,将无RF327的菌株命名为Ps.sp.BSi20327A。在Ps.sp.BSi20327A中检测不到单链的丝状噬菌体的存在,其噬菌体基因的转录水平仅为Ps.sp.BSi20327的3%-7%。通过比较Ps.sp.BSi20327与Ps.sp.BSi20327A在生长速率、群落密度、耐受性和运动性方面的不同,发现f327可以减慢宿主的生长速率、降低宿主群落密度、削弱宿主对高盐和H202的耐受性,但是可以增强宿主的运动能力。对Ps.sp.BSi20327与Ps.sp.BSi20327A在不同盐度培养下的转录组分析,揭示了f327影响宿主的分子机制。当在3%的NaCl浓度下,f327存在的宿主Ps.sp.BSi20327中除了噬菌体的基因表达上调外,宿主染色体上的噬菌体休克蛋白基因(Psp)、与鞭毛组装相关的基因和细菌趋化性基因表达上调。而噬菌体的表达组装以及鞭毛的组装都是耗能的过程,所以这两个过程耗能的增多导致Ps.sp.BSi20327在3%的NaCl下生长速度减慢。在8%的NaCl浓度下除了上述基因在Ps.sp.BSi20327中表达上调外,与表达TCA循环中关键酶有关的基因在Ps.sp.BSi20327中表达下调,从而导致了Ps.sp.BSi20327产能的减少。此外转录延伸因子基因和核糖体蛋白基因在Ps.sp.BSi20327表达下调,这使得Ps.sp.BSi20327中基因转录和翻译的速率降低。因此在8%的NaCl下f327大量表达不仅消耗更多的能量而且还影响宿主能量的产生和基因的转录与翻译,从而导致在8%的NaCl下Ps.sp.BSi20327的生长速率大幅降低。细菌通常会通过从外界吸收或自身合成相容性溶质(包括谷氨酸、脯氨酸及糖类等)来抵抗外界的高渗环境,当NaCl浓度由3%升高到8%时,与氨基酸运输有关的基因以及参与谷氨酸和脯氨酸合成的基因在Ps.sp.BSi20327和Ps.sp.BS120327A中都上调表达,但是Ps.sp.BSi20327中上调表达的幅度更大,尤其是在8%的NaCl下的表达量要高于在Ps.sp.BSi20327A中的表达量。因为这些基因与相容性溶质的积累和抵抗外界高渗环境有关,所以由以上结果可以推断,8%的NaCl对Ps.sp.BSi20327产生的高渗压力要比对Ps.sp.BSi20327A产生的压力大。因此Ps.sp.BSi20327需要积累更多的相容性溶质来抵抗外界的高渗环境。这从另一个侧面说明f327的大量表达导致了Ps.sp.BSi20327耐盐性的降低。而f327的存在使得宿主中与鞭毛合成相关的基因以及趋化性基因的表达上调,使得宿主的运动性提高。根据以上结果,我们提出了f327调控假交替单胞菌宿主群落以适应不同季节海冰环境变化的模型：在冬季,由于低温和极夜,海冰中的细菌面对着高盐和缺乏的营养。,f327通过降低宿主生长速度和高盐耐受性而减小宿主细菌群落的规模从而减少营养的消耗；与此同时,f327可以提高宿主的运动能力,帮助宿主更快的到达适合其生长的环境;在夏季,随着温度的升高、海冰的融化,虽然海冰中的盐度降低,但是由于极昼长时间的日照,海冰中的细菌面对着高浓度的H2O2和丰富的营养。f327通过减低宿主群落密度和H2O2的耐受性,避免宿主群落在营养物质非常丰富时过度地繁殖,从而对生态系统产生破坏。因此,虽然丝状噬菌体不裂解宿主,但是可以温和地调控宿主群落,使其适应北极海冰环境的季节性变化。我们的研究结果首次揭示了海冰丝状噬菌体的生态功能及其介导的假交替单胞菌适应海冰环境的机制。二、Pseudoalteromonassp.SM9913基因敲除体系的建立深海细菌Ps.sp.SM9913分离自1815m的深海沉积物,是一株适冷菌。通过对Ps.sp.SM9913的全基因组测序,从基因水平上发现它含有其它环境中的假交替单胞菌没有的一些特性,可能与其适应深海沉积物环境有关。然而由于遗传操作工具的缺乏,极大地限制了研究该菌适应深海环境的遗传机制。虽然实验室前期工作建立了假交替单胞菌电转化体系,但由于其转化Ps.sp.SM9913的效率极低,无法进行下游的遗传操作。为此本文首先建立了Ps.sp.SM9913高效率转化体系,并在此基础上建立Ps.sp.SM9913基因敲除体系,实现在Ps.sp.SM9913中进行无标记基因敲除。取得以下结果：(1)Ps.sp.SM9913接合转移体系的建立检测了Ps.sp.SM9913对不同抗生素的敏感性,发现其对红霉素具有较高的敏感性,因此将红霉素抗性基因作为在Ps.sp.SM9913中进行遗传操作的筛选标记。实验室前期从北极海冰Ps.sp.BSi20429中筛选到一个内源质粒pSM429,并对其功能区进行了研究。在此基础上,以pGEM-Teasy载体为骨架,先后连入pSM429上与复制有关的最小功能区、接合转移起始序列和红霉素抗性基因,构建成能进行接合转移的Pseudoalteromonas-Escherichiacoli穿梭载体pOriT-4EM。利用pOriT-4EM,以E.coliET12567(pUZ8002)为供体菌,通过优化接合转移条件,建立了Ps.sp.SM9913高效接合转移体系,其接合转移效率为1.8×10-3。为在Ps.sp.SM9913中进行遗传操作奠定基础。(2)Ps.sp.SM9913基因敲除体系的建立以Ps.sp.SM9913多糖合成基因簇中的糖基转移酶基因epsT为靶基因,构建基因敲除体系。选择epsT基因上下游各700-800bp的DNA片段作为同源臂,以红霉素抗性基因作为正向筛选标记,以果聚糖蔗糖酶基因(sacB)为负向筛选标记,通过改造pOriT-4EM,构建了进行epsT基因敲除的自杀载体pMT。利用接合转移将pMT转入Ps.sp.SM9913中,经过两次同源重组,筛选到了epsT基因的缺失突变株,该突变株的胞外多糖产量比野生菌下降了73%左右。在epsT基因敲除过程中,没有在Ps.sp.SM9913染色体上引入任何筛选标记,因此可以利用相同的筛选标记在Ps.sp.SM9913中进行多次基因敲除。并利用该方法敲除了Ps.sp.SM9913的多个基因。这为深入研究深海微生物的环境适应机制提供了技术手段。三、假交替单胞菌适冷异源表达体系的建立随着适冷微生物的不断发现和研究,由其产生的适冷酶因其巨大的研究价值和应用潜力而引起越来越多的关注。然而由于适冷酶的热稳定性差,在高温表达时容易发生错误折叠而形成没有活性的蛋白,所以利用目前最常用的中温大肠杆菌表达体系表达适冷酶时常常得不到有活性的成熟酶,仅以包涵体的形式存在。虽然可以通过降低大肠杆菌的生长温度来提高适冷酶的表达效率,但这大大延长了表达所用的时间。因此发展以适冷菌为宿主的表达体系,将对适冷酶的理论研究和实际应用具有重要意义。实验室前期工作将北极海冰细菌Ps.sp.BSi20429中的质粒pSM429消除,得到了质粒消除菌株Ps.sp.SM20429。并以Ps.sp.SM20429为宿主,利用大肠杆菌lac启动子初步构建了一个表达体系,但其表达温度为25-30℃,无法实现蛋白的适冷表达。因此本文通过构建报告载体筛选低温下的强启动子,并进一步构建表达载体,以Ps.sp.SM20429为宿主进行适冷酶的低温表达。取得以下结果：(1)Ps.sp.SM20429接合转移体系和报告载体的构建及低温启动子的筛选用氯霉素抗性基因替换了pOriT-4EM的红霉素抗性基因,获得质粒pOriT-4CM。在构建的Ps.sp.SM9913接合转移体系的基础上,以Ps.sp.SM20429为受体菌,建立了Ps.sp.SM20429接合转移体系,其接合转移效率约为4×10-3。将红霉素抗性基因和来自北极海冰Ps.sp.BSw20308的适冷纤维素酶基因作为报告基因,利用Ps.sp.BSi20429的冷休克蛋白、热休克蛋白和木聚糖酶基因的启动子,在pOriT-4CM的基础上构建了一系列报告载体。将报告载体转入Ps.sp.SM20429,通过检测转化子的红霉素抗性发现只有含冷休克蛋白基因和木聚糖酶基因启动子的报告载体表达了红霉素抗性基因。通过纤维素酶的活性的比较,发现冷休克蛋白基因和木聚糖酶基因启动子都能够调控纤维素酶基因在5-15℃表达,而木聚糖酶基因的启动子在10-15℃具有更高的强度,更适合表达载体的构建。因此选择木聚糖酶启动子,进一步完善构建适冷表达体系。(2)适冷表达体系的建立和适冷酶的表达实验室前期研究表明,蛋白酶pseudoalterin是南海沉积物细菌Ps.sp.CF6-2所产的主要胞外蛋白酶,该蛋白酶是一个新型的M23家族的蛋白酶,为适冷酶,其最适酶活温度为25℃,并且具有很差的热稳定性。该酶具有很高的弹性蛋白降解活性,是一个弹性蛋白酶。由于该酶的成熟过程不是自成熟,其成熟过程需要其它酶的参与,该酶无法在大肠杆菌中异源表达得到成熟酶的形式。以pOriT-4CM为骨架,连入木聚糖酶基因的启动子,并在其下游分别连入多克隆位点和His-tag,构建表达载体pEV。通过克隆pseudoalterin的基因到pEV中木聚糖酶基因启动子的下游,构建了pseudoalterin的表达载体。将该表达载体转入Ps.sp.SM20429中,利用燕麦木聚糖作为诱导剂,通过优化诱导剂的浓度和诱导温度,表达出了成熟的pseudoalterin,并利用其携带的His-tag,通过亲和层析纯化了pseudoalterin,并进行了N端测序,其序列与野生菌所产的pseudoalterin一致。表达量达到16-20U/ml,比活252±13U/mg。利用构建的适冷表达系统,还成功表达并纯化了增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和两个来自Ps.sp.SM9913的与胞外多糖合成相关的适冷酶,N-乙酰葡糖胺差向异构酶和N-乙酰-D-甘露糖胺脱氢酶。该表达体系的建立为深入研究某些适冷酶的催化机制以及适冷酶的大量制备奠定了基础。
【作者】于子超；
【导师】陈秀兰；张玉忠；
【作者基本信息】山东大学，微生物学，2014，博士
【关键词】假交替单胞菌；丝状噬菌体；北极海冰；深海适冷菌；遗传操作体系；适冷酶；适冷表达体系；

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