负性共刺激分子B7-H4与PI3K/AKT信号通路相关性及机制的研究

【摘要】B7-H4分子是B7家族共刺激分子家族的一员，能负性调控T细胞免疫反应。早期的研究证明，B7-H4是跨膜蛋白，参与调节免疫反应。本实验室的前期研究发现，B7-H4分子含有核定位序列（NLS），能够穿梭于细胞质与细胞核之间。细胞膜上表达的B7-H4分子已被证实可通过抑制T细胞的增殖来促进肿瘤的生长，而对细胞核B7-H4分子的研究并不多见，个别研究发现，细胞内B7-H4分子与细胞的增殖和凋亡相关。磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路与细胞的生长、增殖和肿瘤的发生、发展密切相关，并且会参与细胞内一些蛋白分子的转位。研究发现，B7-H4可以通过抑制活化T细胞中的AKT信号通路，影响T细胞的增殖，但是，对于PI3K/AKT信号通路对B7-H4亚细胞定位的调节作用尚不清楚。本研究旨在构建B7-H4野生型与核定位序列突变型稳定转染的细胞株，初步研究各稳转细胞株的生物活性，并以野生型B7-H4稳转细胞株为研究对象，通过控制PI3K/AKT信号通路的活性，探讨其与B7-H4亚细胞定位的关系。本论文主要包括以下两部分内容：一、人B7-H4基因转染细胞株的构建及其生物学功能的初步研究
【作者】宋慧；
【导师】章良；
【作者基本信息】苏州大学，微生物与生化药学，2014，硕士
【目的】构建B7-H4WT/293、B7-H4H250Q/293和Mock/293稳定转染细胞株，并对其生物学功能进行初步研究。
【方法】将野生型B7-H4基因（B7-H4-WT）、突变体B7-H4基因（B7-H4-MT）和真核质粒pIRES2-EGFP基因用脂质体共转染法分别转染进入HEK/293细胞，经G418加压筛选，分别用流式细胞术鉴定稳定转染细胞株，通过免疫荧光观测经LMB处理后的B7-H4WT/293和B7-H4H250QMT/293中B7-H4定位情况，并通过体外增殖率分析实验和SCID鼠异种移植成瘤实验检测各转基因细胞的体内和体外增殖率。
【结果】构建了三株稳定转染的细胞株：B7-H4WT/293、B7-H4H250Q/293和Mock/293，免疫荧光结果验证了人B7-H4核定位序列的存在，对体内和体外生物学功能的研究显示，细胞核B7-H4对细胞增殖有促进作用。
【结论】成功构建了三株稳定转染的细胞，为进一步研究细胞核B7-H4的作用机制提供了有效地研究工具。二、PI3K/AKT信号通路对B7-H4亚细胞定位调节作用的研究
【目的】探讨磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路对负性共刺激分子B7-H4亚细胞定位的调控作用。
【方法】体外培养稳定转染B7-H4WT/293细胞株，采用PI3K/AKT特异性抑制剂LY294002处理细胞后，免疫荧光技术结合激光共聚焦显微镜检测B7-H4蛋白在B7-H4WT/293细胞中亚细胞定位的变化；Westernblot法检测分别用PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002、PI3K/AKT信号通路活化剂IGF-1、PI3K/AKT信号通路下游mTORC1抑制剂Rapamycin和PI3K/AKT信号通路下游MDM2抑制剂Nutlin-3处理后，B7-H4蛋白在细胞膜、细胞质和细胞核中量的变化。
【结果】激光共聚焦显微镜观察结果显示，PI3K抑制剂LY294002作用于B7-H4稳定转染的B7-H4WT/293细胞株后，与空白对照组相比，B7-H4发生核转移，加入出核转运抑制剂LMB后，核转移的程度显著增加；Westernblot结果显示，LY294002抑制PI3K/AKT信号通路活性24h后，B7-H4在细胞膜和细胞质中的定位均显著性降低（P<0.05），而细胞核中B7-H4的定位显著升高（P<0.05）；IGF-1活化PI3K/AKT信号通路后，B7-H4在细胞膜的定位显著增加，与LY294002作用结果相反，说明PI3K/AKT信号通路参与调节B7-H4的亚细胞定位。Rapamycin作用后B7-H4定位变化与LY294002作用类似，但Nutlin-3作用后，B7-H4的定位并没有发生显著变化，提示PI3K/AKT信号通路对B7-H4亚细胞定位的调节可能通过PI3K-AKT-mTORC1途径参与介导。
【结论】PI3K/AKT信号通路参与调控B7-H4分子在亚细胞水平的定位，并且这一调节作用可能由PI3K-AKT-mTORC1途径参与介导。
【关键词】B7-H4；细胞增殖；PI3K/AKT信号通路；亚细胞定位；核转移；

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