褪黑素预处理对新生期反复惊厥所致神经行为损伤的干预及机制初探

【摘要】目的：探讨褪黑素预处理对三氟乙醚所致新生期反复惊厥大鼠远期神经行为、海马苔藓纤维再生性发芽及相关分子表达的影响。方法：生后6d（用P6表示，下同）的健康Sprague-Dawley（SD）大鼠72只随机分为四组(n=18只/组)：正常对照组（Contrast,CON表示）、褪黑素空白对照组（MEL表示）、惊厥组（RecurrentSeizures，RS表示）及褪黑素组（RS+MEL表示）。通过三氟乙醚反复吸入建立新生期大鼠反复惊厥动物模型：RS组每日吸入三氟乙醚诱导惊厥发作5次，每次间隔30min，连续9d；CON组与RS组同样操作但不吸入三氟乙醚；RS+MEL组于惊厥前1h腹腔注射55mg/kg褪黑素（Melatonin,MEL），同样方法吸入三氟乙醚诱导惊厥发作，操作同RS组;MEL组，与RS+MEL组同样操作但不吸入三氟乙醚。末次惊厥后3h,每组各随机取6只大鼠共24只，分别取大脑皮质及海马，用免疫印迹技术（Westernblot）检测Beclin-1、Bcl-2的表达。于生后P24，P31进行神经行为学评分（平面翻正实验、负向趋地反应实验、悬崖回避实验、前肢悬吊实验）；于P28-P35天行Morris水迷宫试验，于P35天行旷场行为试验，测试大鼠学习记忆功能及认知情感能力。于P35天行为学测试结束后分别取大脑皮层及海马组织，用免疫印迹技术（Westernblot）检测锌离子转运体3（ZnT3）、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMKII）、ACAT-1以及CathepsinE的表达。于P35天采用Neo-Timm’s染色法观测海马苔藓纤维发芽的程度及分布情况。结果：1、免疫印迹法显示：（1）RS组海马和皮质中急性期Beclin-1的表达明显高于CON组（P＜0.05）；与RS相比，RS+MEL组Beclin-1在海马和大脑皮层的表达均明显降低（P＜0.05）。RS+MEL组与CON组相比无明显差异（P＞0.05），CON组与MEL组相比无明显差异（P＞0.05）。（2）RS组海马和皮质中急性期Bcl-2蛋白的表达明显低于CON组（P＜0.05）；与RS相比，RS+MEL组Bcl-2在海马和大脑皮层的表达均明显升高（P＜0.05）。RS+MEL组与CON组相比无明显差异（P＞0.05），CON组与MEL组相比无明显差异（P＞0.05）。2、行为学结果：（1）与CON组相比，RS组（P24、P31）负向趋地反应时间和悬崖回避时间均明显延长（P＜0.05），平面翻正时间、前肢悬吊时间（P24、P31）明显缩短（P＜0.05）；与RS组比较，RS+MEL组大鼠（P24、P31）负向趋地反应时间和悬崖回避时间均明显缩短（P＜0.05），平面翻正时间、前肢悬吊时间（P24、P31）明显延长（P＜0.05）。（2）旷场实验显示：RS组延迟时间较CON组明显延长（P＜0.05）；RS组水平运动次数少于CON组（P＜0.05）,而RS+MEL组较RS组增多（P＜0.05)。（3）Morris水迷宫检测：〈1〉四组逃避潜伏期于测试第1d至第5d有逐渐缩短趋势;测试第2,4,5天，RS组逃避潜伏期较CON组明显延长（P＜0.05）,RS+MEL组逃避潜伏期较RS组明显缩短（P＜0.05）。〈2〉空间探索测试：RS组穿越平台次数较CON组明显减少（P＜0.05）。3、Neo-Timm’s染色结果显示：RS组海马齿状回及CA3区苔藓纤维发芽程度显著高于CON组（P＜0.01），RS+MEL组海马齿状回及CA3区苔藓纤维发芽程度较RS组明显减轻（P＜0.05）。CON组和RS+MEL组Timm’s颗粒分布无明显差异（P＞0.05）。4、免疫印迹法显示：（1）RS组海马和皮质中ZnT3、ACAT-1、CathepsinE的表达明显高于CON组（P＜0.05）；与RS相比，RS+MEL组ZnT3、CathepsinE在海马和大脑皮层的表达均明显降低（P＜0.05）。与RS相比，RS+MEL组ACAT-1在海马中的表达明显降低（P＜0.05）。RS+MEL组与CON组相比无明显差异（P＞0.05），CON组与MEL组相比无明显差异（P＞0.05）。（2）RS组海马和皮质中CaMKII蛋白的表达明显低于CON组（P＜0.05）；与RS相比，RS+MEL组CaMKII在海马和大脑皮层的表达均明显升高（P＜0.05）。RS+MEL组与CON组相比无明显差异（P＞0.05），CON组与MEL组相比无明显差异（P＞0.05）。结论：1、三氟乙醚诱导新生期反复长程惊厥能够导致神经行为及学习能力损伤，同时造成海马齿状回及CA3区苔藓纤维异常发芽增强，并使大脑皮质及海马急性期Beclin-1表达上调、Bcl-2表达下调，并使远期ZnT3、ACAT-1、CathepsinE表达升高，CaMKII蛋白表达下降。2、惊厥发作前应用MEL进行干预，能显著改善惊厥所致神经行为及学习能力损伤。3、惊厥发作前应用MEL进行干预，能明显抑制反复惊厥所致海马齿状回及CA3区苔藓纤维发芽程度，并可调节海马及大脑皮层急性期自噬/凋亡标记蛋白Beclin-1、Bcl-2和远期ZnT3、CaMKII、ACAT-1、CathepsinE蛋白的表达。4、本研究提示，急性期自噬/凋亡通路分子和远期ZnT3、CaMKII、ACAT-1、CathepsinE表达参与MEL对新生期惊厥性脑损伤神经保护作用的调节机制，上述分子的内在联系和相互作用有待进一步探讨。
【作者】孙奇；
【导师】倪宏；
【作者基本信息】苏州大学，儿科学，2014，硕士
【关键词】惊厥；新生期；褪黑素；苔藓纤维发芽；Beclin-1；Bcl-2；ZnT3；CaMKII；ACAT-1；CathepsinE；

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