二甲双胍联合吉西他滨抑制人胰腺癌细胞株CFPAC-1生长及机制的实验研究

【摘要】第一部分二甲双胍对人胰腺癌细胞株CFPAC-1的影响及机制目的：研究二甲双胍（Metformin，Met）在体外对人胰腺癌细胞株CFPAC-1生长增殖、凋亡的影响，并初步探讨其可能的作用机制。方法：在体外培养人胰腺癌细胞株CFPAC-1，应用不同浓度的Met(0、1、2.5、5、10、20、40、60mmol/L)进行干预24、48、72h。用细胞增殖与毒性检测法（CCK-8）检测OD值，计算对照组和各实验组CFPAC-1细胞的抑制率，并计算最适宜的MetIC50；取Met浓度为0、10、20、40mmol/L处理胰腺癌CFPAC-1细胞48h后进行流式细胞术分析细胞周期变化；AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡率；反转录聚合酶链反应（ReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction，RT-PCR）检测FASmRNA、CyclinD1mRNA、Bcl-xlmRNA、BaxmRNA、SurvivinmRNA、Caspase-3mRNA表达水平的变化；蛋白质印迹法（Westernblot）检测P-AMPK、FAS、CyclinD1、Bcl-xl、Bax、Survivin、Caspase-3蛋白表达变化。结果：（1）CCK-8法显示Met可明显抑制CFPAC-1细胞的增殖，呈浓度—时间依赖性（P<0.05）。（2）流式细胞术及AnnexinV/PI早期凋亡检测显示：CFPAC-1细胞经Met作用48小时后，细胞周期G0/G1期比例上升，从(42.89±1.02)%上升至(65.98±0.27)%，（P<0.05）。细胞凋亡明显，以早期凋亡为主，10mmol/L浓度下早期凋亡率为(13.77±1.31)%，20mmol/L浓度下为(22.63±1.45)%，而40mmol/L浓度下为(32.97±3.19)%，凋亡率与Met浓度呈正相关（P<0.05）。（3）RT-PCR检测FASmRNA、CyclinD1mRNA、Bcl-xlmRNA、BaxmRNA、SurvivinmRNA、Caspase-3mRNA表明CFPAC-1细胞经Met作用48小时后，FASmRNA、CyclinD1mRNA、Bcl-xlmRNA、SurvivinmRNA的表达呈浓度依赖性下降，BaxmRNA、Caspase-3mRNA呈浓度依赖性上升，各浓度组与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。（4）WesternBlot结果显示Met作用于CFPAC-1细胞48h后可使细胞中的P-AMPK蛋白表达增强，FAS、CyclinD1表达减弱；Bcl-xl、Survivin表达下调，Bax、Caspase-3表达上调，差异具有统计学意义（P<0.05）。结论：Met呈浓度—时间依赖性抑制胰腺癌CFPAC-1细胞的生长，其机制可能是激活AMPK信号通路，从而下调FAS表达影响细胞代谢、下调CyclinD1表达阻滞细胞周期于G0/G1期从而抑制细胞增殖；并且还能诱导细胞发生早期凋亡。第二部分二甲双胍联合吉西他滨对人胰腺癌细胞株CFPAC-1的影响目的:探讨二甲双胍联合吉西他滨（Gemcitabine，GEM）对人胰腺癌细胞株CFPAC-1的协同抑制作用及可能机制。方法:以浓度为20mmol/L的二甲双胍联合低浓度（5μmol/L）的吉西他滨处理对数生长期的人胰腺癌细胞株CFPAC-1，应用CCK-8法检测OD值，计算对照组和各实验组CFPAC-1细胞的增殖抑制率；AnnexinV/PI双染法检测细胞早期凋亡情况；RT-PCR检测细胞凋亡因子Bcl-xl、Bax、Survivin、Caspase-3的mRNA表达水平；蛋白质印迹法（WestenBlot）检测凋亡蛋白Bcl-xl、Bax、Survivin、Caspase-3的表达水平。结果:Met和GEM都能有效地抑制人胰腺癌CFPAC-1细胞增殖，二者联合作用后抑制效应显著增强。Met组作用CFPAC-1细胞48h后细胞早期凋亡为（24.53±2.18）%，GEM组为（22.37±1.61）%，联合组为（52.07±2.81）%。Met组、GEM组及联合组Bcl-xl、SurvivinmRNA及蛋白表达下调，Bax、Caspase-3mRNA及蛋白表达上调，各组与对照组、联合组与单药组相比均有统计学意义（P<0.05）。结论：二甲双胍联合吉西他滨对人胰腺癌细胞株CFPAC-1增殖具有协同抑制作用，其机制可能是通过促进细胞凋亡而发挥作用。
【作者】贺志龙；
【导师】许春芳；
【作者基本信息】苏州大学，消化病学，2014，硕士
【关键词】二甲双胍；胰腺癌；AMPK信号通路；细胞增殖；凋亡；吉西他滨；协同效应；

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