间充质干细胞通过隧道纳米管转运线粒体减轻内皮细胞缺血损伤并改善大鼠缺血性卒中预后的研究

【摘要】前言缺血性脑血管疾病已成为严重威胁人类健康的重大疾病,并造成了严重的社会经济负担。尽管缺血性脑血管疾病的治疗研究取得了一定进展,但是现有的治疗手段仍十分有限,治疗效果并不理想。近年来,干细胞移植在缺血性脑血管疾病治疗中的应用研究,为解决这一难题提供了新的思路和方法。作为一种被广泛研究的多能干细胞,骨髓来源的间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)可以自身取材,既不产生免疫排斥反应,也不存在伦理问题,是目前较为理想的种子细胞。在缺血性脑血管疾病中,血管内皮的损伤是主要的起病始动因素；而血管的修复,尤其是缺血半暗区受损血管的修复,又是挽救缺血受损神经元的前提；同时脑微血管内皮细胞的损伤是也导致血脑屏障开放、脑水肿发生,从而加重神经元细胞损伤的重要因素。因此,保护和修复脑血管的内皮细胞才是防治缺血性脑血管疾病的关键。然而,目前在于细胞治疗脑梗死的研究中,多数研究聚焦于受损神经组织的修复,但在干细胞对缺血部位受损的脑血管内皮细胞影响的研究却亟待进一步深入。近期的研究提示,移植的间充质干细胞可以促进缺血局部区域的血管新生并减轻缺血组织的损伤；然而,其具体机制仍存在争议：部分学者认为干细胞通过转分化为缺血损伤的血管组织细胞促进了血管再生,另有学者认为移植的干细胞可以通过细胞融合发挥其保护作用,更有学者认为间充质干细胞通过其旁分泌的细胞因子促进了血管新生。因此,针对移植的间充质干细胞与缺血再灌注损伤的微血管及内皮细胞之间的相互作用需要进一步的研究。在缺血再灌注损伤的复杂机制中,线粒体损伤是其中的关键环节。线粒体在有氧代谢、氧化磷酸化和细胞凋亡等多种病理生理过程中发挥着关键作用。有研究显示线粒体损伤的严重程度在一定程度上决定了内皮细胞的功能和命运,并影响到后续的血管新生及缺血组织的修复。然而,当前关于干细胞对损伤的内皮细胞线粒体功能影响的实验研究尚未见报道。目前,一种新型通讯连接方式的发现正在引发人们对细胞通讯认识的革命：最近在动物细胞间发现了一种细长膜管状细胞连接一隧道纳米管((tunnelingnanotubes,TNTs)。作为细胞间相互交流的通道,TNTs可以在相连接的细胞间形成复杂的通讯网络,并能够运输多种细胞组分以促进细胞间的相互交流,其中不仅包括细胞膜的成分、细胞质内的小分子,甚至线粒体等一些较大的细胞器也能通过TNTs进行转运。越来越多的研究提示TNTs是动物细胞间一种普遍存在的相互作用方式。由此我们提出以下假设：干细胞可以建立起与内皮细胞的直接连接方式——TNTs,并通过TNTs将自身的线粒体直接转运至内皮细胞中,修复受损内皮细胞的能量代谢,减少细胞凋亡,以保护内皮细胞、修复缺血受损的脑微血管系统,从而发挥其减轻缺血性卒中损伤并改善卒中预后的作用。TNTs的发现揭示了一种全新的细胞间交流通道,引发了人们对细胞相互作用方式的重新思考,直到目前其研究仍处于初步阶段,许多问题还有待于进一步解决。我们在前期实验的基础上,结合干细胞和TNTs的最新研究进展,提出了干细胞通过TNTs直接转移线粒体以保护缺血受损内皮细胞的推测,以图揭示出干细胞修复缺血受损脑血管内皮细胞的机制,为干细胞在缺血性卒中治疗的临床应用提供了基础实验依据,同时也为干细胞治疗其他缺血性疾病的机制研究提供了借鉴。第一部分间充质干细胞通过隧道纳米管转运线粒体保护类缺血n损伤的内皮细胞的研究研究目的1、探讨间充质干细胞与共培养的脐静脉内皮细胞间能否建立TNTs结构联系。2、探究影响TNTs形成的因素并揭示TNTs的形成机制。3、探讨线粒体能否通过TNTs在两种细胞间进行有效的转运。4、探讨干细胞能否通过建立TNTs转运线粒体以保护类缺血损伤的内皮细胞。研究方法1、骨髓间充质干细胞与脐静脉内皮细胞的分离、培养、鉴定与标记。密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞,经培养扩增后,流式细胞术鉴定间充质干细胞表型为CD29、CD44和CD105阳性,CD34和CD45阴性。脐静脉内皮细胞获赠于山东大学心血管蛋白质组重点实验室。采用慢病毒介导的增强型绿色荧光蛋白标记间充质干细胞,并通过流式细胞分选术将其纯化。另外,应用pAcGFP1-Mitovector和pDsRed2-Mitovector分别对脐静脉内皮细胞和骨髓间充质干细胞的线粒体进行标记。2、对比分析正常条件下骨髓间充质干细胞与脐静脉内皮细胞的线粒体功能。通过生物能量代谢监测仪分析细胞的耗氧率(oxygenconsumptionrate,OCR)和产酸率(extracellularacidificationrate,ECAR),经细胞计数校正后的耗氧率和产酸率数值可直接反映出MSCs和HUVECs的线粒体功能差异。3、建立干细胞与类缺血损伤后内皮细胞的共培养模型。在缺氧培养箱中对HUVECs实施氧糖剥夺处理150分钟,再将处理的细胞进行复氧复糖处理,4小时后将等量的间充质干细胞与之直接混合培养,以建立干细胞与类缺血损伤后内皮细胞的共培养模型。4、激光共聚焦显微镜观察隧道纳米管的形成及线粒体在其中的转运。应用激光共聚焦显微镜观察共培养的MSCs和HUVECs之间隧道纳米管的形成以及线粒体在其中的转运情况,并对不同干预条件下的两种细胞间形成的TNT及膜突起(membraneprotrusions,MPs)计数统计。5、应用流式细胞术分选并定量分析混合培养后两种细胞间线粒体的相互转移率。利用Hoechst33342标记的间充质干细胞细胞核,以及干细胞和内皮细胞两种细胞间的形态差异,采用流式细胞分选术将共培养48小时后的两种细胞分选开来。再应用流式细胞术定量分析线粒体在两种细胞间的相互转移率。6、分析间充质干细胞对共培养脐静脉内皮细胞的有氧代谢、细胞活性及凋亡率的影响；并检测丝状肌动蛋白(filamentousactin,F-actin)解聚剂latrunculin-A(LatA)、磷脂酰丝氨酸位点阻断剂AnnexinV和线粒体功能缺失的干细胞对其共培养效应的影响。采用流式细胞分选术将不同的共培养组中的脐静脉内皮细胞分离出来。采用FITCAnnexinV凋亡试剂盒分析内皮细胞凋亡率,采用CellCountingKit-8(CCK-8)分析内皮细胞活性,使用生物能量代谢监测仪分析内皮细胞的线粒体功能。7、分析干细胞的旁分泌功能和细胞融合等因素对内皮细胞活性的影响。收集浓缩不同处理条件下的间充质干细胞条件培养液,应用ELISA试剂盒检查其中的血管内皮细胞生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)、血小板源性生长因子(platelet-derivedgrowthfactorBB,PDGF-BB)和成纤维细胞生长因子-2(fibroblastgrowthfactor2,FGF-2)的含量,以明确干细胞的旁分泌功能对内皮细胞活性的影响。采用直接测序法对比检测共培养前后的HUVECs和MSCs的线粒体DNA(mitochondrialDNA,mtDNA),明确共培养后被MSCs营救的HUVECs是否含有来源于MSCs的线粒体。应用短串联重复序列方法对比分析共培养前后的HUVECs和MSCs的核DNA(nuclearDNA,nDNA),明确共培养后被MSCs营救的HUVECs是否含有来源于MSCs的细胞核,也即是分析细胞融合的可能性。将染色标记好的血小板和干细胞线粒体加入缺血受损的内皮细胞中直接共培养,激光共聚焦显微镜观察共培养48小时后的内皮细胞的生存状况,从而分析内皮细胞是否主动吞噬了细胞外游离的线粒体。研究结果1、生物能量代谢监测仪分析证实间充质干细胞具有显著优于脐静脉内皮细胞的线粒体功能(p<0.05)。2、激光共聚焦显微镜证实共培养的间充质干细胞与脐静脉内皮细胞间可建立隧道纳米管结构联系,线粒体可在其中进行双向转运(两种细胞间的双向转移率大致均衡)。3、激光共聚焦显微镜证实类缺血再灌注损伤能介导脐静脉内皮细胞与间充质干细胞间建立更为复杂和广泛的网络状TNT联系,并促使TNT中的线粒体双向交换变为单向转运(由干细胞向内皮细胞方向),且(流式细胞术证实)其转移率显著提高。4、LatA和AnnexinV可显著减少脐静脉内皮细胞与间充质干细胞间的TNTs数量,表明TNTs的形成是依赖F-actin的聚合和磷脂酰丝氨酸的外化的过程。5、间充质干细胞通过隧道纳米管将自身线粒体转运至类缺血再灌注损伤的脐静脉内皮细胞内,以修复其有氧代谢功能并减少细胞凋亡。F-actin解聚剂LatA、磷脂酰丝氨酸位点阻断剂AnnexinV均可显著抑制该保护效应(p<0.05)。另外,尽管线粒体功能缺失的MSCs完全丧失了对内皮细胞有氧代谢功能的修复,但仍可以部分减轻内皮细胞的凋亡(p<0.05),这提示TNTs还可能通过转运其他物质的方式发挥其对内皮细胞的保护效应。6、LatA和AnnexinV的处理对间充质干细胞的旁分泌促血管新生作用细胞因子(VEGF,PDGF-BB,FGF-2)的功能没有显著影响,因此间充质干细胞的旁分泌功能不是其保护内皮细胞的关键机制。另一方面,被拯救的脐静脉内皮细胞的nDNA来源母系的内皮细胞,而其：ntDNA则同时含有MSCs和母系内皮细胞两种组分,这一结果不仅支持线粒体在异种细胞间发生了转移,同时也排除了发生细胞融合的可能性。此外,将染色标记好的血小板和干细胞线粒体加入缺血损伤的内皮细胞中直接共培养48小时,内皮细胞的线粒体功能、细胞活性和凋亡率均没有明显改善,且细胞中未发现含有被染色标记的线粒体,表明缺失损伤后的脐静脉内皮细胞不具有主动吞噬线粒体的功能。第二部分间充质干细胞保护大鼠脑微血管系统线粒体的功能并改善缺血性卒中预后的研究研究目的1、研究间充质干细胞移植对大脑中动脉闭塞后再灌注大鼠的脑梗死面积的影响。2、探讨间充质干细胞移植对脑梗死大鼠运动神经功能恢复的影响。3、研究间充质干细胞对脑梗死大鼠缺血脑组织血管新生的影响。4、探讨间充质干细胞移植对缺血受损脑微血管的线粒体功能的影响。5、进一步探讨隧道纳米管介导的线粒体转移机制在干细胞改善脑梗死大鼠预后中的作用。研究方法1、建立大鼠的大脑中动脉闭塞后再灌注模型。线栓法制备大鼠的大脑中动脉闭塞(middlecerebralarteryocclusion,MCAO)后再灌注模型。在MACO120分钟后撤出尼龙线恢复大脑中动脉的灌注,术中采用多普勒仪证实闭塞和再灌注的效果。术后对大鼠进行神经功能缺损评分,并根据评分结果选取大鼠进人下一步实验2、建立经动脉途径将间充质干细胞植入缺血损伤的大鼠脑微血管系统的模型。对大鼠的间充质干细胞进行分离、培养和鉴定。为示踪移植的干细胞及其线粒体,用Hoechst33342标记MSCs的细胞核,应用pDsRed2-Mitovector对干细胞的线粒体进行标记。在大脑中动脉闭塞再灌注术后24小时,使用显微注射针将5×105MSCs缓慢注入右侧颈内动脉系统并密切观察术中术后的大鼠病情变化。3、2,3,5-氯化三苯基四氮唑染色法分析大鼠脑梗死体积。间充质干细胞移植术7天后,采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride,TTC)对不同处理组大鼠梗死后的脑组织进行染色,应用ImageJ软件进一步分析梗死体积。4、测试脑梗死大鼠的运动神经功能。应用转棒疲劳实验和跑轮实验对MCAO术前及MSCs移植术后的第1、7、14和28天的大鼠进行测试,以评估间充质干细胞移植及其它不同处理因素对脑梗死大鼠的运动神经功能恢复的影响。5、探讨脑微血管的密度与接受移植干细胞线粒体的宿主细胞数量间的关系。受试大鼠接受动脉注射的绿色荧光染料(fluoresceinisothiocyanate-dextranamine,FD-2000S)以达到激光共聚焦显微镜下脑微血管充分显影的效果。将脑组织固定并制作冰冻切片。共聚焦显微镜下观察梗死核心区和缺血半暗区的脑微血管的密度与接受干细胞线粒体的宿主细胞(DsRed2+/Hoechst33342-cells)数量间的关系。6、分离纯化脑微血管片段,并检测其线粒体功能。取梗死侧的大脑半球,采用两次酶消化法和密度梯度离心法分离和纯化脑微血管片段。将纯化的脑微血管片段置于Ⅳ型胶原和纤连蛋白覆盖的XF24组织培养皿内,使用生物能量代谢监测仪分析微血管片段的线粒体功能。研究结果1、间充质干细胞移植显著减少大脑中动脉闭塞大鼠的脑梗死面积(p<0.05)。2、间充质干细胞移植可促进脑梗死大鼠运动功能的恢复(p<0.05)。3、间充质干细胞移植显著增加缺血半暗区的脑微血管密度(p<0.05)。4、间充质干细胞可有效改善缺血损伤脑微血管片段的线粒体功能(p<0.05)。5、LatA和AnnexinV并不影响缺血半暗区内DsRed2+/Hoechst33342+细胞的数量(DsRed2+/Hoechst33342+细胞即为示踪出的植入术后全部的MSCs,包括了可能发生细胞融合和转分化的MSCs),证实LatA和AnnexinV对干细胞的归巢、滞留和迁移没有造成显著影响。然而,TNTs的抑制剂LatA和AnnexinV可显著减少缺血半暗区内DsRed2+/Hoechst33342-细胞的数量(DsRed2+/Hoechst33342-细胞为接受干细胞转移线粒体的宿主细胞),同时也显著抑制了干细胞的对脑梗死大鼠的保护效应(p<0.05),提示其保护效可能与隧道纳米管介导的线粒体转移密切相关；同时也进一步证实了旁分泌功能、细胞融合和转分化等因素不是干细胞保护效应的关键机制。综上所述1、骨髓间充质干细胞具有显著优于脐静脉内皮细胞的线粒体功能。间充质干细胞与内皮细胞间可建立隧道纳米管结构联系,两种细胞的线粒体可在其中进行双向转运。正常条件下两种细胞之间线粒体的转运频率大致均等。2、类缺血再灌注损伤能介导内皮细胞与间充质干细胞间建立更为广泛和复杂的TNTs联系网络,并促使TNTs介导的线粒体双向均等交换转变为从干细胞向内皮细胞方向的单向转运,其转移率也显著提高。从而使间充质干细胞能有效修复受损内皮细胞的线粒体功能并减少细胞凋亡。3、TNTs的形成可能反映了细胞在应激或损伤状态下表现出的一种自我防御和营救机制。TNTs的形成依赖于丝状肌动蛋白的聚合以及磷脂酰丝氨酸位点的外化与识别。4、体内实验进一步证实：间充质干细胞通过隧道纳米管转运线粒体可能是其保护缺血受损脑微血管的线粒体功能、促进血管新生并改善卒中大鼠的预后的关键机制。而间充质干细胞的旁分泌细胞因子、细胞融合或转分化机制则并非其保护作用的主要因素。
【作者】刘恺鸣；
【导师】焉传祝；
【作者基本信息】山东大学，神经病学，2014，博士
【关键词】缺血性脑卒中；间充质干细胞；内皮细胞；线粒体；隧道纳米管；

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