清醒自由移动动物光栓缺血造模及相应行为学检测

【摘要】缺血性中风是一类由脑部供血不足引起脑组织和脑功能损伤的疾病。缺血性中风动物模型尤其是在清醒动物中制作疾病模型以及行为学检测,早已成为基础研究和新药研发的重要组成部分。过去主流的缺血性中风动物模型多在麻醉动物上造模,相应的行为学检测结果并不稳定。基于此,本论文的研究工作致力于建立一种在清醒自由移动动物上,利用光化学栓塞方法制造缺血性中风的动物模型,并进行实时的行为学检测。过去主流的缺血性中风动物模型,如颈总动脉闭合、大脑中动脉闭合等,都是在麻醉条件下通过急性手术进行缺血性中风的模型制作,并随即进行行为学检测。由于动物需要至少7天才能从麻醉和手术中康复,这种研究策略就带来了许多难以控制的因素,比如麻醉剂对缺血和神经损伤的影响,手术过程中的应激对缺血和神经损伤的影响,以及缺血本身对手术后康复的影响等等。另外,绝大多数的人类缺血性中风均不可能发生在麻醉和手术条件下,因此在麻醉动物上建立的缺血性中风模型不能有效地反映病人的情况。这也是为什么过去几十年来几十种新药在中风动物模型中有效,但在临床试验中失败的根本原因。因此,国际STAIR(StrokeTherapyAcademicIndustryRoundtable)标准最新推荐,必须要在清醒动物中进行缺血模型制作,才能准确地评价治疗中风药物的有效性。为解决这些问题,我首先在清醒自由移动小鼠上建立了缺血性中风模型。在麻醉条件下,利用脑立体定位仪把光纤导管埋植到小鼠海马脑区。手术后让动物恢复7天,直到动物可以正常活动时,再进行光栓缺血造模。腹腔注射玫瑰红(100mg/kg)后让动物吸收1小时,将光纤插入光纤导管,分别给予不同光源照射30分钟。24小时后用TTC(2,3,5-Triphenyltetrazoliumchloride)染色检测缺血损伤程度,发现在这种条件下,473nm激光照射30分钟造模效果最佳。接下来,利用这种方法,在清醒小鼠初级运动皮层进行光栓缺血造模并检测其运动能力。主要采用转棒(rotarod)和踏步测试(rungwalk)来检测缺血发生前后小鼠的运动协调性和平衡能力。在小鼠单侧初级运动皮层埋管7天后,动物得到很好康复。光栓缺血造模前训练小鼠进行转棒和踏步测试。经过两天的训练得到动物运动协调性和平衡能力的基本数据。第三天,进行匀速转棒测试的同时在小鼠单侧运动皮层光照造模：腹腔注射玫瑰红(100mg/kg)1小时后,将光纤插入小鼠单侧初级运动皮层,然后将小鼠放在转棒仪上进行匀速转棒测试,同时给予30分钟473nm光照。光照前10分钟,小鼠腹腔注射尼莫地平(151ng/kg,抗缺血药物)或空白溶剂(10ml/kg)。接下来进行连续6天的转棒和踏步测试。光照后第1天、第7天分别用跑步机检测小鼠的运动耐力。在光栓缺血造模后的不同时间点(15分钟、1天、3天、7天),选取一些小鼠进行TTC染色,检测缺血损伤随时间的变化。研究发现不论是脑组织缺血还是运动能力的损伤,最早出现在光照结束后第15分钟,24小时后损伤加重；3天后开始恢复,并最终在光照后第7天得以基本恢复。此外,在现有范式中,尼莫地平能够促进光栓缺血后神经损伤的修复过程。然后,我与周恒博士研究生合作,把这一技术方案应用于清醒自由移动的SpragueDawley(SD)大鼠,检测海马和杏仁核光栓缺血对背景条件恐惧记忆不同加工阶段的影响。首先验证了在SD大鼠上也能成功造模。在光栓缺血造模后5小时、24小时和7天分别取脑制作脑片进行TTC染色或是电生理检测。结果发现,不论是杏仁核还是海马,在光栓缺血造模后5小时就已经产生较严重的神经损伤,24小时后损伤最显著,7天后又能够部分恢复。接下来,通过事先埋植光纤导管,待动物恢复后,在恐惧记忆训练前5小时、训练后立刻和提取前5小时分别在清醒大鼠的海马和杏仁核进行光栓缺血造模,检测相应脑区光栓缺血对恐惧记忆的学习、巩固和提取的影响。结果显示,海马缺血降低了恐惧记忆的提取成绩；杏仁核缺血既干扰记忆的巩固又损伤记忆的提取。此外,训练前5小时在海马或杏仁核进行光栓缺血造模,动物的学习能力和短时程记忆都不受影响。但是,训练前5小时同时在海马和杏仁核造模,动物的学习能力和短时记忆都受损。最后,我还探索了在灵长类动物树鼩上建立光栓缺血模型。初步结果显示,这一方法也能在树鼩海马中成功地诱导出缺血损伤。总之,这种光栓缺血的技术方法,不仅能够在清醒自由移动的动物中进行中风模型制作,也能进行实时的行为学评价和药物干预有效性评价,为缺血性中风相关的基础研究和治疗缺血性神经损伤的新药研发提供全新的方法。用这一新的技术方法进行缺血性中风模型制作和行为学评价,目前还未见任何报道,具有显著的创新性。
【作者】于成龙；
【导师】徐林；
【作者基本信息】中国科学技术大学，神经生物学，2014，硕士
【关键词】清醒自由移动动物；行为学检测；光栓缺血；背景条件恐惧记忆；树鼩；

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