STAMP2与糖尿病动脉粥样硬化关系的实验研究
【摘要】背景2型糖尿病大血管病变的主要病理改变是动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS),而动脉粥样硬化斑块破裂所导致的急性冠脉综合征(ACS)则是糖尿病患者心脏事件的主要原因。但是,糖尿病患者冠状动脉病变严重、易损斑块发生率高的机制目前尚未完全阐明。因此,急性心血管病事件作为威胁人类生命的头号杀手,其防治已成为世界性公共卫生的重点和难题。因此积极而深入研究这一机制具有非常重要的意义。胰岛素抵抗(insulinresistance,IR)作为2型糖尿病的基本特征,能够引起糖脂代谢的紊乱,从而增加动脉粥样硬化斑块的形成和不稳定。分析糖尿病猝死患者的冠状动脉的病理结构后可以发现,在动脉粥样硬化斑块破裂处存在大量凋亡的巨噬细胞,而远离动脉粥样硬化斑块破裂处的细胞凋亡现象并不明显。因此,巨噬细胞的凋亡特别是晚期凋亡可以导致动脉粥样硬化斑块的破裂,继发血栓形成,最终引起急性冠脉综合征。巨噬细胞凋亡的信号调控中Akt信号转导分子是关键一步。Akt信号通路的障碍能导致巨噬细胞糖耐量异常、胰岛素抵抗和发生凋亡。因此发生胰岛素抵抗的巨噬细胞更易发生凋亡,促进动脉粥样硬化斑块的不稳定性。在体内实验中,激活Aktl的特殊治疗可能会增加动脉粥样硬化斑块的稳定性,减少动脉粥样硬化斑块的形成；但进一步的体外实验结果表明：Akt1的减少能降低巨噬细胞对低密度脂蛋白(LDL)的摄取,意味着Akt1可能有致动脉粥样硬化作用。PI3K/Akt通路的激活能增加病变处巨噬细胞的存活,但持续的激活能促进动脉粥样硬化的发生。综上所述,我们需要一个关键分子通过调控胰岛素抵抗通路进而精确调控Akt分子的活性。即这一分子能调节细胞的正常糖代谢,缺乏该分子时能够导致胰岛素抵抗的发生,同时其产物活性亦受胰岛素抵抗状态的调节。这一关键分子即是本研究的焦点所在。有研究表明,六跨膜蛋白STAMP2可能就是满足这些条件的关键分子。STAMP2,最初被命名为前列腺跨膜上皮抗原(six-transmembraneepithelialantigenofprostate4,STEAP).STAMP2可参与调节细胞的糖代谢,缺失时引起Akt信号通路受损和胰岛素胞外分泌过程受损,导致细胞的糖代谢受损和胰岛素抵抗。此外STAMP2能在人和小鼠的动脉硬化斑块中表达,能调控巨噬细胞形成泡沫细胞,推动小鼠动脉硬化的进程。可见,STAMP2在胰岛素抵抗和易损斑块的形成中起桥梁性作用。对此,我们提出STAMP2/Akt信号传导途径可能是在糖尿病状态下胰岛素抵抗、巨噬细胞凋亡和易损斑块形成的共同中间环节的设想。在这项研究中,我们以2型糖尿病ApoE-/LDLR-/-小鼠作为模型动物,研究在体情况下,STAMP2对Akt信号途径和巨噬细胞凋亡的影响以及稳定2型糖尿病易损斑块的可行性,进一步揭示STAMP2基因的生物学功能,为今后寻找相应的靶点治疗打下研究基础,为降低斑块易损性提供临床治疗上的理论依据。目的1.建立2型糖尿病ApoE-/LDLR-小鼠动脉粥样硬化模型；2.构建STAMP2过表达重组腺病毒载体,合成STAMP2过表达腺病毒；3.将2型糖尿病ApoE-/LDLR-小鼠体内转染STAMP2过表达重组腺病毒后,观察在整体功能水平、组织学水平上,STAMP2基因过表达后稳定2型糖尿病易损斑块的作用及其信号转导机制。方法1.STAMP2过表达腺病毒的合成：根据小鼠STAMP2基因序列(Genebank),设计合成引物,克隆小鼠STAMP2mRNA,PCR扩增STAMP2基因,回收目的基因并亚克隆至表达载体,经测序鉴定正确后,应用BDAdeno-XTMExpressionSystem2腺病毒载体构建系统,构建含小鼠STAMP2基因的腺病毒质粒。经转染293细胞行病毒包装、扩增及纯化,得到小鼠STAMP2过表达腺病毒；2.动物实验：(1)2型糖尿病动物模型的建立：3周龄雄性ApoE-/LDLR-小鼠40只,适应性喂养24h后,随机分为普通饮食组(n=20)和糖尿病组(n=20)。两组小鼠禁食12h后,进行IPGTT。至两组小鼠9周龄时,再次进行IPGTT,糖尿病组小鼠出现胰岛素抵抗的个体可给予一次性腹腔注射小剂量的STZ75mg/kg。2周后检测IPGTT,出现随机血糖>11.1mmol/L的糖尿病组小鼠可作为2型糖尿病成模的动物入组；(2)小鼠体内转染STAMP2过表达腺病毒：两组小鼠20周龄时,按照不同干预措施再次分组。普通饮食组随机分为：普通饮食空载体组(n=10)和普通饮食+STAMP2过表达组(n=10)；糖尿病组随机分为：糖尿病空载体组(n=10)和糖尿病+STAMP2过表达组(n=10)。普通饮食+STAMP2过表达组和糖尿病+STAMP2过表达组小鼠经颈静脉注射STAMP2过表达腺病毒；普通饮食空载体组和糖尿病空载体组小鼠经颈静脉注射对照空载体腺病毒。两周后,追加相同剂量的过表达腺病毒和对照空载体腺病毒。实验进行至小鼠24周龄时,留取小鼠腹腔原代巨噬细胞,球后血液及组织后处死动物；(3)小鼠体重的称量：使用小动物称量仪定期监测小鼠体重的变化并记录数据；(4)小鼠腹腔葡萄糖耐量试验(IPGTT)：小鼠空腹10-16h,按照1.5g/kg体重给予小鼠腹腔注射葡萄糖,分别于注射后Omin、15min、30min、60min、120min断尾取血检测血糖；(5)小鼠血液生化指标检测：各组小鼠在实验结束时留取球后血液,离心后分别检测空腹血清葡萄糖(FBG)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、游离脂肪酸(FFA)的水平,Elisa法检测血清胰岛素水平,计算胰岛素抵抗指数；(6)小鼠头臂干斑块的病理学检测：①大体油红O染色法观察各组小鼠主动脉斑块负荷情况；②HE染色、油红O染色、Masson染色法和天狼猩红染色测量小鼠头臂干动脉斑块斑块的面积、脂质含量、胶原含量及Ⅰ型胶原与Ⅲ型胶原的比值；③免疫组化方法检测小鼠头臂干斑块内巨噬细胞(MOMA-2)、平滑肌肌动蛋白(a-actin)的含量,计算易损指数；④TUNEL法检测小鼠头臂干斑块内的细胞凋亡量以及巨噬细胞的凋亡量；(7)小鼠腹腔巨噬细胞功能的检测：分离并培养小鼠腹腔巨噬细胞后检测小鼠腹腔巨噬细胞的粘附功能、迁移功能、吞噬功能和凋亡情况；3.小鼠主动脉STAMP2mRNA表达量的检测：Trizol法提取小鼠主动脉STAMP2RNA,逆转录后,利用SYBRGREEN法检测各组小鼠主动脉STAMP2mRNA的表达量；4.小鼠主动脉STAMP2蛋白表达量的检测：取小鼠新鲜整根主动脉约20mg,提取蛋白质,Westernblot检测斑块内STAMP2、Akt、p-Akt、caspase-3和Bcl-2的蛋白表达量；结果1.动物造模：3周龄雄性ApoE-/LDLR-/-小鼠40只,随机分为普通饮食组和糖尿病组。普通饮食组饲以基础饲料,糖尿病组饲以高糖高脂饮食。6周后测IPGTT;出现胰岛素抵抗的小鼠一次性腹腔注射小剂量链脲佐菌素(STZ)。11周龄时测IPGTT,随机血糖≥11.1mmol/L的糖尿病组小鼠作为2型糖尿病成模的动物入组。①糖耐量实验(IPGTT)结果：ApoE-/LDLR4小鼠3周龄时,与普通饮食组相比,糖尿病组的IPGTT结果无统计学差异(P>0.05)；ApoE-/LDLR–/-小鼠9周龄时,与普通饮食组相比,糖尿病组的IPGTT结果具有统计学意义(P均<0.05),血糖曲线下面积(AUC)明显增加(P<0.05)；ApoE-/LDLR-小鼠11周龄时,普通饮食与糖尿病组的IPGTT结果差异具有统计学意义(P均<0.05),血糖曲线下面积(AUC)亦明显增加(P<0.05)。普通饮食组小鼠不同周龄的IPGTT结果差异无统计学意义(P>0.05)；糖尿病组小鼠不同周龄的IPGTT结果差异具有统计学意义(P<0.05)。②体重变化情况：ApoE-/LDLR-小鼠3周龄时,普通饮食组和糖尿病组小鼠的体重差异无统计学意义(P<0.05)；高脂高糖饮食和基础饮食分别喂养6周后,两组ApoE-/LDLR-小鼠体重均明显增加。与普通饮食组ApoE-/LDL–/-小鼠相比,糖尿病组ApoE-/LDLR-小鼠体重明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05)；注射链脲佐菌素后2周,糖尿病组ApoE-/LDLR-小鼠体重增加速度减慢,此时,与普通饮食组ApoE-/-/LDLR-/-小鼠相比,糖尿病组ApoE-/LDLR-小鼠的体重无明显增加,差异无统计学意义(P>0.05)；以高脂高糖饮食继续喂养ApoE-/LDLR-/-小鼠至20周龄时,与普通饮食组小鼠相比,糖尿病组小鼠的体重明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05)；随后ApoE-/LDLR-小鼠体重继续增加,至22周龄时达到最大值,糖尿病组小鼠体重仍然明显大于普通饮食组小鼠体重,差异具有统计学意义(P<0.05);至ApoE-/LDLR-小鼠24周龄时,普通饮食组小鼠和糖尿病饮食组小鼠的体重均略有下降,但是糖尿病组小鼠体重仍然明显大于普通饮食组小鼠的体重,差异具有统计学意义(P<0.05)。③主动脉斑块负荷情况：24周龄ApoE-/LDLR-/-小鼠经高脂高糖饮食联合小剂量链脲佐菌素后,主动脉斑块负荷严重,结果表明此糖尿病小鼠模型能够发生动脉粥样硬化斑块。2.STAMP2过表达腺病毒转染①STAMP2过表达腺病毒载体构建、合成：利用BDAdeno-XTMExpressionSystem2腺病毒构建系统,构建出包含小鼠STAMP2基因的腺病毒载体(pLP-Adeno/STAMP2)并包装到病毒上,经腺病毒包装,扩增,纯化后得到滴度为2×1011PFU/mL的腺病毒。②STAMP2过表达腺病毒转染：在ApoE-/-/LDLR-/-小鼠20周龄时,将普通饮食组和糖尿病组ApoE-/-/LDLR-小鼠各分为普通饮食空载体组(Control+Vehicle组)(n=10)、普通饮食+STAMP2过表达组(Control+STAMP2组)(n=10)、糖尿病空载体组(DM+Vehic1e组)(n=10)、糖尿病+STAMP2过表达组(DM+STAMP2组)(n=10)。普通饮食+STAMP2过表达组和糖尿病+STAMP2过表达组ApoE-/LDLR-/-小鼠经颈静脉注射STAMP2重组过表达腺病毒5×109PFU/只,普通饮食空载体组及糖尿病空载体组注射相同剂量的空载体病毒,2周后以相同剂量补充注射一次。腺病毒注射4周后处死动物并留取标本。糖尿病空载体组ApOE-/LDLR–/-小鼠主动脉STAMP2mRNA表达量与普通饮食空载体组ApoE-/LDLR-小鼠相比,明显减少(P<0.01)；普通饮食+STAMP2过表达组ApoE-/LDLR-/-小鼠主动脉STAMP2mRNA表达量与普通饮食空载体组ApoE-/LDLR-/-小鼠相比,虽然增加(P=0.22),但差异无统计学意义；糖尿病+STAMP2过表达组ApoE-/LDLR-/-小鼠主动脉STAMP2mRNA表达量与糖尿病空载体组ApoE-/LDLR-/-小鼠相比,明显增加(P<0.05)。3.一般情况的改变：在ApoE-/LDLR-/-小鼠22周龄时,糖尿病空载体组ApoE-/LDLR-小鼠体重与普通空载体组ApoE-/LDLR-/-小鼠相比,明显增高(P<0.01)；普通饮食+STAMP2过表达组ApoE-/LDLR–/-小鼠体重与普通空载体组ApoE-/LDLR-小鼠相比,略有下降,但差异无统计学意义(P>0.05)；糖尿病+STAMP2过表达组ApoE-/LDLR-小鼠体重与糖尿病空载体组ApoE-/LDLR–/-小鼠相比,也略有下降,差异无统计学意义(P>0.05)。在ApoE-/LDLR-小鼠24周龄时,糖尿病空载体组ApoE-/LDLR-/-小鼠体重与普通空载体组ApoE-/LDLR-/-小鼠相比,明显增高(P<0.05)；普通饮食+STAMP2过表达组ApoE-/LDLR-/-小鼠体重与普通空载体组ApoE-/LDLR-/-小鼠相比,略有增加,但差异无统计学意义(P>0.05)；糖尿病+STAMP2过表达组ApoE-/LDLR-小鼠体重与糖尿病空载体组ApoE-/LDLR-/-小鼠相比,略有下降,差异无统计学意义(P>0.05)。与普通饮食空载体组ApoE-/LDLR-小鼠相比,糖尿病空载体组ApoE-/LDLR-/-小鼠血糖水平、胰岛素抵抗指数和总胆固醇水平均明显升高(P均<0.001),血清胰岛素水平、甘油三酯水平和游离脂肪酸水平增加,但差异无统计学意义(P均>0.05)；与普通饮食空载体组ApoE-/LDLR-小鼠相比,普通饮食+STAMP2过表达组ApoE-/LDLR-/-小鼠血糖、血清胰岛素水平和胰岛素抵抗指数降低,但差异无统计学意义(P均>0.05),但是小鼠血清总胆固醇、甘油三酯和游离脂肪酸水平增加,差异没有统计学意义(P均>0.05)；与糖尿病空载体组ApoE-/LDLR-小鼠相比,糖尿病+STAMP2过表达组ApoE-/LDLR-小鼠血糖、血清胰岛素水平和胰岛素抵抗指数明显降低(P均<0.01),血清总胆固醇、甘油三酯和游离脂肪酸水平略有降低,差异无统计学意义(P均>0.05)。4.头臂干斑块的病理学改变情况：糖尿病空载体组ApoE-/LDLR-/-小鼠与普通饮食空载体组ApoE-/LDLR-小鼠相比,头臂干动脉斑块面积、斑块内脂质含量和斑块内巨噬细胞含量明显升高(P均<0.001)；糖尿病+STAMP2过表达组ApoE-/LDLR-小鼠与糖尿病空载体组ApoE-/LDLR-/-小鼠相比,头臂干动脉斑块面积、斑块内脂质含量和斑块内巨噬细胞含量明显降低(P均<0.001)；普通饮食+STAMP2过表达组ApoE-/LDLR–/-小鼠与普通饮食空载体组ApoE-/LDLR–/-小鼠相比,头臂干动脉斑块面积、斑块内脂质含量明显降低(P均<0.01),斑块内巨噬细胞含量略有降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。糖尿病空载体组ApoE-/LDLR-小鼠与普通饮食空载体组ApoE-/LDLR-/-小鼠相比,头臂干动脉斑块内胶原含量和平滑肌含量明显降低(P均<0.01),头臂干动脉斑块Ⅰ型和Ⅲ型胶原比值略有降低,但差异无统计学意义(P>0.05)；糖尿病+STAMP2过表达ApoE-/LDLR-小鼠与糖尿病空载体组ApoE-/LDLR-/-小鼠相比,头臂干动脉斑块内胶原含量和Ⅰ型和Ⅲ型胶原比值明显增加(P均<0.05),头臂干动脉斑块内平滑肌含量略有增加,但差异无统计学意义(P>0.05)；普通饮食+STAMP2过表达组ApoE-/LDLR-/-小鼠与普通饮食空载体组ApoE-/LDLR-/-小鼠相比,头臂干动脉斑块内Ⅰ型和Ⅲ型胶原比值和平滑肌含量明显增加(P均<0.001),头臂干动脉斑块内胶原含量略有增加,但差异无统计学意义(P>0.05)。糖尿病空载体组ApoE-/LDLR-小鼠与普通饮食空载体组ApoE-/LDLR–/-小鼠相比,头臂干动脉斑块易损指数明显升高(P<0.001)；糖尿病+STAMP2过表达ApoE-/LDLR-小鼠与糖尿病空载体组ApoE-/LDLR-小鼠相比,头臂干动脉斑块易损指数降低(P<0.001)；普通饮食+STAMP2过表达ApoE-/LDLR–小鼠与普通饮食空载体组ApoE-/LDLR-小鼠相比,头臂干动脉斑块易损指数降低(P<0.05)。5.头臂干斑块内细胞和巨噬细胞凋亡情况：糖尿病空载体组ApoE-/LDLR-小鼠与普通饮食空载体组ApoE-/LDLR-/-小鼠相比,头臂干动脉斑块的细胞凋亡明显升高(P<0.001)；糖尿病+STAMP2过表达ApoE-/LDLR-小鼠与糖尿病空载体组ApoE-/LDLR-/-小鼠相比,头臂干动脉斑块的细胞凋亡降低(P<0.001)；普通饮食+STAMP2过表达ApoE-/LDLR-小鼠与普通饮食空载体组ApoE-/LDLR-/-小鼠相比,头臂干动脉斑块细胞凋亡降低(P<0.001)。糖尿病空载体组ApoE-/LDLR-/-小鼠与普通饮食空载体组ApoE-/LDLR-小鼠相比,头臂干动脉斑块的巨噬细胞凋亡明显升高(P<0.001)；糖尿病+STAMP2过表达组ApoE-/LDLR-小鼠与糖尿病空载体组ApoE-/LDLR-/-小鼠相比,头臂干动脉斑块的巨噬细胞凋亡降低(P<0.001)；普通饮食+STAMP2过表达组ApoE-/LDLR–/-小鼠与普通饮食空载体组ApoE-/LDLR-/-小鼠相比,头臂干动脉斑块巨噬细胞凋亡降低(P<0.01)。6STAMP2/Akt信号通路表达情况：糖尿病空载体组ApoE-/LDLR-/-小鼠与普通饮食空载体组ApoE-/LDLR-小鼠相比,主动脉血管内STAMP2蛋白质表达明显减少(P<0.01),Akt磷酸化程度降低(P<0.001),caspase-3蛋白表达增多(P<0.001),抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少(P<0.01)。糖尿病+STAMP2过表达ApoE-/LDLR-/-小鼠与糖尿病空载体组ApoE-/LDLR–/-小鼠相比,血管内STAMP2蛋白质表达明显增加(P<0.001),Akt磷酸化程度增加(P<0.001),caspase-3蛋白表达降低(P<0.001),Bcl-2蛋白表达增加(P<0.001);普通饮食+STAMP2过表达ApoE-/LDLR-/-小鼠与普通饮食空载体组ApoE-//LDLR-/-小鼠相比,血管内STAMP2蛋白质表达明显增加(P<0.001),Akt磷酸化程度增加(P<0.05),caspase-3表达降低(P<0.001；),Bcl-2表达增加(P<0.001)。7.小鼠腹腔巨噬细胞功能的情况：糖尿病空载体组ApoE-/LDLR-/-小鼠与普通空载体组ApoE-/LDLR-/-小鼠相比,腹腔原代巨噬细胞粘附功能、迁移功能、吞噬功能明显增强,凋亡比例明显增加(P均<0.05)。与糖尿病空载体组ApoE-/LDLR-小鼠相比,经过STAMP2腺病毒转染后的糖尿病+STAMP2组ApoE-/LDLR-小鼠,其巨噬细胞粘附功能明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),迁移功能明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05),吞噬功能显著增强,差异具有统计学意义(P<0.05),凋亡比例明显减少,差异具有统计学意义(P<0.01)。经过STAMP2过表达腺病毒转染后,与普通空载体组ApoE-/LDLR-小鼠相比,普通饮食+STAMP2过表达组ApoE-/LDLR-/-小鼠,其腹腔原代巨噬细胞粘附功能略有降低,差异无统计学意义(P>0.05),迁移功能明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05),吞噬功能明显增强,差异具有统计学意义(P<0.05),巨噬细胞凋亡比例明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05)结论(1)3周龄雄性ApoF-/LDLR-小鼠给予高热量饮食喂饲和小剂量STZ注射后,建立2型糖尿病动脉粥样硬化易损斑块小鼠模型；(2)ApoE-/LDLR-小鼠经高脂高糖饮食联合小剂量链脲佐菌素诱发糖尿病后,符合2型糖尿病代谢特点,与人类的糖尿病状态基本类似；(3)经过STAMP2腺病毒转染后,小鼠的体重和糖耐量实验结果降低,胰岛素抵抗状态得到改善；(4)经过STAMP2腺病毒转染后,小鼠的一般代谢指标检测均有不同程度降低,血脂紊乱状况得到有效改善；(5)经过STAMP2腺病毒转染后,小鼠头臂干处斑块面积减小、脂质含量降低、巨噬细胞凋亡减少、胶原增加、平滑肌细胞增加、斑块易损性明显下降；(6)经过STAMP2腺病毒转染后,斑块内Akt活性增加,caspase-3蛋白表达降低,Bcl-2蛋白表达增加,斑块处巨噬细胞凋亡减少；(7)经过STAMP2腺病毒转染后,小鼠腹腔原代巨噬细胞凋亡减少、粘附、迁移功能降低,吞噬功能有所增加。背景动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)及其并发症引起的急性心血管病事件已成为人类的头号杀手,其防治一直是世界性公共卫生的重点和难题。急性冠状动脉综合征(acutecoronarysyndrome,ACS)是冠状动脉粥样硬化性心脏病最重要的死因。ACS最主要的深层原因是易损斑块的形成,即易于发生血栓或可能迅速进展成为罪犯病变的斑块。目前认为动脉粥样硬化整个过程均与细胞凋亡有关。细胞凋亡在不稳定斑块形成中的作用也逐渐受到重视。免疫组化表明活化的Caspase-3(凋亡的主要执行分子)在平滑肌细胞、内皮细胞、巨噬细胞内有不同程度的表达,表明在斑块中这些细胞均存在着凋亡现象。其中巨噬细胞凋亡是造成动脉粥样硬化斑块不稳定的主要因素。在动脉粥样硬化病变发生的早期,斑块内巨噬细胞具有足够的吞噬清除凋亡细胞的能力。此时,巨噬细胞凋亡可减少病变细胞成分,抑制病变进展。而在晚期病变中,许多因素可引起巨噬细胞吞噬清除凋亡细胞的功能受损。此时,巨噬细胞凋亡会进一步加剧斑块内吞噬清除能力的下降,导致斑块内凋亡细胞的继发性坏死、炎症反应加剧。因此,在动脉粥样硬化晚期,巨噬细胞的凋亡不利于斑块的稳定。可见巨噬细胞晚期凋亡在能否维持动脉粥样硬化斑块稳定中有着重要意义,因此,对巨噬细胞凋亡的研究则成为探讨动脉粥样硬化的发生机制及易损斑块发生率高的关键领域。巨噬细胞凋亡的信号调控是一个复杂的网络体系,在各种刺激因子的作用下,Akt、核因子-κB(NF-κB)、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)等信号分子均参与巨噬细胞凋亡调控过程。其中Akt信号转导途径起关键作用。增加巨噬细胞Akt活性可抑制凋亡效应,而Akt去磷酸化或降解则促进细胞凋亡发生。Akt的上述作用主要是通过对下游关键的Bcl家族成员及caspases家族成员调节实现。同时,Akt亦是调节糖代谢和胰岛素抵抗信号通路的关键效应分子。随着对Akt研究的深入,发现Akt还可从多个不同环节调控糖代谢,引起血糖降低,提示Akt在正常糖稳态和胰岛素抵抗中起着重要的作用。STAMP2最初被命名为前列腺跨膜上皮抗原(six-transmembraneepithelialantigenofprostate4,STEAP4),属于STAMP或STEAP家族。STAMP2基因定位于7q21,其编码的蛋白质由459个氨基酸残基组成,因结构上存在6个跨细胞膜区域而又称为六跨膜蛋白。Wellen等证实,STAMP2基因缺失可导致脂肪细胞Akt的磷酸化明显降低,Akt信号传导通路受损,胰岛素抵抗和糖代谢受损,提示STAMP2基因在调控Akt活性、胰岛素抵抗以及代谢稳态平衡中发挥关键作用。同时,我们以往研究结果表明：STAMP2基因在2型糖尿病ApoE-/LDLR-小鼠斑块处表达明显降低。因此我们推测STAMP2可能作为一种的关键性基因通过调节Akt活性从而影响巨噬细胞的凋亡,从而在动脉粥样硬化易损斑块的发生发展中发挥重要的调节作用。目的1.观察高糖刺激下小鼠巨噬细胞STAMP2mRNA及蛋白质的表达情况；2.观察高糖刺激下小鼠巨噬细胞凋亡及细胞功能变化情况；3.探讨STAMP2/Akt信号转导通路在高糖诱导的小鼠巨噬细胞凋亡中的作用；4.探讨STAMP2/Akt信号转导通路对小鼠巨噬细胞功能变化的影响。方法1.高糖刺激下小鼠巨噬细胞STAMP2的表达：将巨噬细胞分为3组：正常糖组(含5.5mmol/L葡萄糖)、高糖组(含25mmol/L葡萄糖)、高渗组(含5.5mmol/L葡萄糖+19.5mmol/L甘露糖),分别于培养后的0h、4h、8h、12h、16h、20h和24h收集细胞,RT-PCR法和Westernblot法分别检测不同刺激条件、时间对STAMP2mRNA和蛋白质的表达；2.高糖刺激下小鼠巨噬细胞凋亡的检测：将巨噬细胞分为3组：正常糖组、高糖组、高渗组,分别于培养后的0h、24h、48h和72h收集细胞,分别利用Westernblot法和FACS进行巨噬细胞凋亡的检测；3.高糖刺激下P13K/Akt信号通路在小鼠巨噬细胞凋亡中的作用：以P13K抑制剂LY294002(10gmol/L)预处理培养的小鼠巨噬细胞1小时后加入高糖刺激,继续培养细胞48h后,利用Westernblot法检测Akt信号通路及凋亡蛋白的表达情况；4.高糖刺激下小鼠巨噬细胞功能的检测：将巨噬细胞分为3组：正常糖组、高糖组、高渗组,分别于培养后的16h在铺被多聚赖氨酸的Costar培养板上进行巨噬细胞的粘附实验；利用Transwell法检测小鼠巨噬细胞的迁移功能；激光共聚焦法和流式细胞仪检测小鼠巨噬细胞的吞噬功能；5STAMP2siRNA转染小鼠巨噬细胞：将处于生长对数期的小鼠巨噬细胞种于12孔板中,将浓度分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0μgSTAMP2siRNA及对照controlsiRNA转染小鼠巨噬细胞6-8h。荧光显微镜下观察细胞的转染效率,筛选出最佳转染浓度并收集细胞提取蛋白,利用、VesternBlot法检测抑制STAMP2后蛋白表达水平.经验证,最佳转染浓度为0.5μg,此浓度下STAMP2siRNA转染效率约为60%,转染效果最显著,后续实验均按照此转染浓度进行。6.高糖刺激下STAMP2siRNA转染小鼠巨噬细胞STAMP2/Akt信号通路及细胞功能的检测：将小鼠巨噬细胞种于12孔板中,设对照组(加入对照controlsiRNA0.5gg)和干扰组(加入STAMP2siRNA0.5μg)。经STAMP2siRNA转染后,高糖刺激小鼠巨噬细胞12h,WesternBlot检测小鼠巨噬细胞STAMP2/Akt通路上各信号分子表达情况；Transwell法等小鼠巨噬细胞的迁移、粘附、吞噬功能及细胞凋亡情况；7.STAMP2过表达腺病毒转染小鼠巨噬细胞：将小鼠巨噬细胞种于12孔板中,分别用0、50、100、150、200、250MOI(感染指数)的STAMP2过表达腺病毒和对照空载体感染小鼠巨噬细胞24h,再加入高糖(25mmol/L葡萄糖)刺激24h。在荧光显微镜下观察,计算感染率后按照最佳转染率进行后续实验；8.高糖刺激下STAMP2过表达腺病毒转染小鼠巨噬细胞后STAMP2/Akt信号通路及细胞功能的检测：将小鼠巨噬细胞种于12孔板中,设空载体组(加入200MOI对照空载体)和过表达组(加入200MOISTAMP2过表达腺病毒),经STAMP2过表达腺病毒干预过表达STAMP2后,高糖(25mmol/L葡萄糖)刺激小鼠巨噬细胞24h.WesternBlot检测小鼠巨噬细胞STAMP2/Akt通路上各信号分子表达情况；Transwell法等小鼠巨噬细胞的迁移、粘附、吞噬功能及细胞凋亡情况；结果1.高糖刺激对小鼠巨噬细胞STAMP2表达的影响①高糖刺激对小鼠巨噬细胞STAMP2mRNA表达的影响：随着培养时间的延长,高糖组巨噬细胞STAMP2mRNA表达水平逐渐增高,至16h达到高峰(9.90±11.45vs.1.00±0.00,P<0.01),随后高糖组巨噬细胞STAMP2mRNA表达水平逐渐下降,20h仍高于刺激前的水平和正常糖组(P<0.05,P<0.05)；正常糖组STAMP2mRNA表达水平在20h时达到最大值(2.32±0.98vs.1.00±0.00,P<0.01)；高渗组STAMP2mRNA表达水平较刺激前没有明显改变(P>0.05)。②高糖刺激对小鼠巨噬细胞STAMP2蛋白质表达的影响：随着培养时间的延长,高糖组巨噬细胞STAMP2蛋白质表达水平至20h达到高峰(P<0.05),24h高糖组巨噬细胞STAMP2蛋白质表达水平下降；正常糖组和高渗组STAMP2蛋白质表达水平较刺激前无明显增高(P均>0.05)。2.高糖刺激对小鼠巨噬细胞凋亡的影响①高糖刺激对小鼠巨噬细胞凋亡的影响：随着培养时间的延长,高糖组的巨噬细胞caspase-3蛋白表达量明显增加,72h时表达最高,差异有统计学意义(P<0.01)；正常糖组和高渗组巨噬细胞caspase-3蛋白表达量也有所增加,但差异无统计学意义(P均>0.05)。FACS结果发现：随着培养时间的延长,高糖组的巨噬细胞凋亡现象明显增加,24h时即有细胞凋亡现象,48h时细胞凋亡明显增加,72h时凋亡数量最高,差异有统计学意义(P均<0.05)。②P13K/Akt信号通路在高糖促进小鼠巨噬细胞凋亡中的作用：与对照组(高糖组)相比,抑制剂组的Akt磷酸化水平在20h明显下降(0.86±0.01vs.0.95±0.00,P<0.001),在24h和48h也分别明显下降(0.84±4±0.00vs.0.92±0.01,P<0.001)和(0.81±0.01vs.0.81±0.01,P=0.44)；同时与对照组(高糖组)相比,抑制剂组的caspase-3的蛋白水平在20h(1.32±0.02vs.1.30±0.03,P=0.29)和24h(1.36±0.01vs.1.34±0.03,P=0.25)略有下降,但差异无统计学意义,在48h明显下降(1.25±0.07vs.1.38±0.03,P<0.05)；与对照组(高糖组)相比,抑制剂组的抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白水平在20h(0.66±0.02vs.0.68±0.02,P=0.15)和24h(0.68±0.02vs.0.71±0.02,P=0.11)略有增加,但差异无统计学意义,在48h明显增加(0.49±0.01vs.0.63±0.03,P<0.001)。3.高糖刺激对小鼠巨噬细胞功能的影响：与正常糖组和高渗组相比,高糖刺激16h后,小鼠巨噬细胞的粘附个数增加,迁移个数增加,吞噬能力明显增加(P<0.05)。4.STAMP2/PI3K/Akt信号通路在高糖刺激小鼠巨噬细胞凋亡中的作用①STAMP2siRNA转染、干扰：经验证,最佳转染浓度为0.5μg,此浓度下STAMP2siRNA转染效率约为60%,转染效果最显著,后续实验均按照此转染浓度进行。WesternBlot结果显示与对照组比较,干扰组细胞STAMP2蛋白表达量减少20%(0.97±0.03vs.0.78±0.10,P<0.05)。②高糖刺激下STAMP2siRNA转染小鼠巨噬细胞后STAMP2/Akt信号通路活性对细胞凋亡的影响：与对照组相比,干扰组STAMP2蛋白表达明显减少(0.97±0.03vs.0.78±0.10,P<0.05)；P13K磷酸化水平有所降低,但差异无统计学意义(0.82±0.01vs.0.81±0.06,P=0.84)；Akt磷酸化水平显著降低(0.85±0.03vs.0.76±0.06,P<0.05)；caspase-3蛋白表达增加约40%(0.65±0.05vs.0.90±0.02,P<0.001)；抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达下降57%(0.70士0.16vs.0.30±0.23,P<0.05)③高糖刺激下STAMP2siRNA转染小鼠巨噬细胞对巨噬细胞功能的影响：与对照组比较,抑制STAMP2表达后小鼠巨噬细胞的粘附个数明显增加,迁移能力明显增加,吞噬能力明显增加,细胞凋亡率明显增加,差异有统计学意义(P均<0.01)。④STAMP2过表达腺病毒感染小鼠巨噬细胞：在荧光显微镜下观察,感染24小时后,感染指数为200MOI小鼠巨噬细胞荧光强度较大,而且在此感染指数下细胞状态较其他感染指数下细胞状态好,因此后续实验均按照此感染指数进行。收集细胞提取蛋白利用WesternBlot法检测此感染指数下STAMP2蛋白表达较对照组增加约20%(0.82±0.06vs.0.70±0.04,P<0.05)。⑤高糖刺激下STAMP2过表达腺病毒转染小鼠巨噬细胞后STAMP2/Akt信号通路活性对细胞凋亡的影响：过表达组STAMP2蛋白表达与空载体组相比,明显增加(0.82±0.06vs.0.70±0.04；P<0.05)；P13K磷酸化水平变化不明显,差异无统计学意义(0.87±0.03vs.0.86±0.03,P=0.48)；Akt磷酸化水平明显增加(0.76±0.04vs.0.69±0.00,P<0.05);caspase-3蛋白表达降低(0.67±0.06vs.0.76±0.06,P<0.05)；抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达增加(0.72±0.02vs.0.68±0.02,P<0.05)。⑥高糖刺激下STAMP2过表达腺病毒转染小鼠巨噬细胞对巨噬细胞功能的影响：与空载体组比较,过表达STAMP2后小鼠巨噬细胞的粘附能力和凋亡数量明显下降,吞噬能力明显增加(P均<0.01)；迁移个数有所降低,但差异无统计学意义(P=0.09)。结论(1)体外实验中,高糖刺激能够呈时间依赖性的增加小鼠巨噬细胞STAMP2mRNA和蛋白的表达；(2)体外实验中,高糖刺激能够使Akt活性下降,caspase-3蛋白表达增加,增加小鼠巨噬细胞的凋亡；(3)体外实验中,高糖刺激能增加小鼠巨噬细胞的粘附、迁移、吞噬功能；(4)成功构建STAMP2小干扰RNA并合成STAMP2过表达腺病毒；(5)体外实验中,干扰STAMP2基因表达后,在高糖刺激下,小鼠巨噬细胞STAMP2表达下降,Akt活性下降,小鼠巨噬细胞的凋亡增加；同时小鼠巨噬细胞的粘附、迁移、吞噬功能分别有所程度增加；(6)体外实验中,过表达STAMP2基因后,在高糖刺激下,小鼠巨噬细胞STAMP2表达增加,Akt活性增加,小鼠巨噬细胞的凋亡减少；同时小鼠巨噬细胞的粘附、迁移功能降低,吞噬功能增加；
【作者】王佳；
【导师】张薇；
【作者基本信息】山东大学，内科学，2014，博士
【关键词】STAMP2/Akt信号转导通路；2型糖尿病；动脉粥样硬化；巨噬细胞凋亡；胰岛素抵抗；高糖刺激；
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