Profilin-1在自发性高血压大鼠心肌肥大中的作用及机制研究
【摘要】第一部分自发性高血压大鼠心肌肥大的定量比较蛋白质组学研究研究背景心肌肥大是心肌细胞和细胞外间质对血流动力学超负荷和神经体液失调等多种病理刺激的基本应答和代偿反应,是许多心血管疾病(如高血压、心脏瓣膜病、急性心肌梗塞和先天性心脏病)发生发展过程中共有的病理变化。临床流行病学资料显示,心肌肥大导致心源性猝死和心力衰竭的发病率明显增高,严重影响患者的预后,已被列为影响心血管疾病发病率和死亡率的独立危险因子。因此,对心肌肥大发生机制的探讨并寻找有效的预防和治疗措施,具有十分深远的临床意义和科研价值。蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象,探究细胞内所有蛋白质及其动态变化规律的科学,在细胞和生命有机体的整体水平上阐明生命现象的本质和活动规律。同位素标记的相对和绝对定量技术(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation,iTRAQ)是近年来开发的一种新的比较蛋白质组学定量研究技术。iTRAQ技术可对一个基因组表达的全部蛋白质进行精确定量和鉴定,寻找差异表达蛋白,并分析其蛋白功能。与传统的依赖凝胶电泳的定量技术相比,iTRAQ是基于高度敏感性和精确性的串联质谱方法；可同时对4种甚至8种不同来源的样品进行绝对和相对定量研究；不仅可以发现胞浆蛋白,还可发现膜蛋白、核蛋白甚至胞外蛋白；可以检测出低丰度蛋白、强碱性蛋白、小于10kD或大于200kD的蛋白。iTRAQ技术的发展为探讨心肌肥大的发生机制,寻找关键的作用蛋白提供了高效可靠的研究方法。自发性高血压大鼠(SpontaneousHypertensionRat,SHR)是1959年由日本京都大学Okamoto和Aoki培育而成的遗传性高血压动物模型。SHR在遗传特性、发病机制以及高血压心血管并发症等方面均与人类原发性高血压十分相似,是目前国际公认最接近于人类原发性高血压的动物模型。心肌肥大是SHR重要特征之一,高血压性心肌肥大在幼年SHR已出现,并存在于高血压整个自然病程中。因此,本研究选用特定年龄阶段的SHR大鼠为研究对象,采用定量比较蛋白质组学iTRAQ技术,着力于发现SHR大鼠早期心肌肥大发生发展过程中差异表达的功能性蛋白或蛋白群,并利用生物信息学方法分析差异蛋白的分子功能、蛋白分类及生物学过程,筛选并鉴定在高血压性心肌肥大发病过程中起关键作用的蛋白分子,为高血压心肌肥大的防治提供有效靶点。研究目的1.研究自发性高血压大鼠心肌病变的特点,观察5周龄和17周龄SHR大鼠心肌组织的病理学和超微结构变化；2.应用iTRAQ蛋白质组学技术研究SHR大鼠肥大心肌与同周龄WKY大鼠正常心肌组织的差异表达蛋白,从整体水平上揭示高血压心肌肥大病变的病理生理机制,并筛选关键靶蛋白；研究方法4周龄雄性SHR大鼠8只,WKY大鼠8只,16周龄雄性SHR大鼠8只,WKY大鼠8只,适应性饲养1周后(即5周龄和17周龄时)进入实验：1.大鼠尾动脉收缩压测定：处死前通过无创血压测量系统检测各组大鼠尾动脉收缩压；2.心脏质量指数测定：大鼠处死后,称量心脏重和左室重,测量主动脉瓣至心尖的距离为左心室长轴。以左室重/心脏重和左心室长轴作为反应心室肥大的指标；3.心肌组织病理学检测：HE染色观察心肌组织病理变化,天狼星红染色测定胶原纤维面积百分比；4.心肌组织超微结构观察：透射电镜技术观察心肌肌丝、肌节、线粒体及细胞核等亚细胞结构；5.蛋白质组学(iTRAQ)分析：5周龄WKY大鼠(WKY-5)、5周龄SHR大鼠(SHR-5)、17周龄WKY大鼠(WKY-17)和17周龄SHR大鼠(SHR-17)各8只,提取左心室总蛋白。采用胰酶消化蛋白得到肽段,按照ABI公司说明书操作标记肽段,114标记WKY-5组,115标记SHR-5组,116标记WKY-17组,117标记SHR-17组。将各组已标记的肽段混合后用强阳离子交换柱和C18柱进行分离,然后采用MALDI-TOF/TOF和MicroQ-TOF进行质谱鉴定。不同报告基团离子的强度代表其所标记的多肽的相对丰度；6.差异蛋白质功能分析：利用DataAnalysis4.0软件分析质谱数据,用Mascot软件搜索与质谱匹配的蛋白。采用Panther软件(http://www.pantherdb.org/)对差异蛋白进行GO分析,包括分子功能,生物过程和细胞组成三个部分；7.验证profilin-1的表达：采用实时定量聚合酶链反应(qPCR)技术检测各组大鼠心肌组织中profilin-1的mRNA水平,蛋白质免疫印迹方法(Westernblot)检测profilin-1的蛋白表达水平,以验证蛋白质组学的可靠性。研究结果1.大鼠尾动脉收缩压：5周龄WKY大鼠收缩压为111.2±7.6mmHg,5周龄SHR大鼠收缩压为143.1±10.5mmHg,已显著升高(P<0.001),17周龄WKY大鼠收缩压为117.7±8.6mmHg,17周龄SHR大鼠收缩压为216.3±12.1mmHg,收缩压的差异更为显著(P<0.001)。2.大鼠心脏肥大指数：5周龄SHR大鼠的平均LVW/HW比值为0.55±0.02,5周龄WKY大鼠的平均LVW/HW比值为0.54±0.02,两者无显著差异；17周龄SHR大鼠的平均LVW/HW比值为0.77±0.06,同周龄WKY大鼠的平均LVW/HW比值为0.60±0.03,SHR大鼠较WKY大鼠升高28.33%。5周龄SHR大鼠的左室长轴平均长度为6.45±0.33mm,同周龄WKY大鼠的左室长轴平均长度为6.42±0.36mm,两者无显著差异；17周龄SHR大鼠的左室长轴平均长度为13.31±0.67mm,同周龄WKY大鼠的左室长轴平均长度为9.97±0.60mm,SHR大鼠较WKY大鼠升高33.50%。3.大鼠心肌病理学分析3.1心肌HE染色：5周龄及17周龄的WKY大鼠心肌细胞形态正常,排列整齐、致密,肌纤维无断裂,横纹、闰盘及细胞核染色清晰；5周龄SHR大鼠心肌细胞形态、结构及排列基本正常；17周龄SHR大鼠心肌细胞肿胀、内容物成颗粒状,部分细胞间排列稀疏、间隙不清,心肌纤维断裂、融合呈波浪状改变,多数横纹、闰盘尚清晰,细胞核肥大或固缩,个别视野心肌间质纤维化；横截面上可见心肌细胞直径增宽,单个心肌细胞面积明显增加。3.2心肌天狼星红染色：WKY大鼠心肌间质几乎无胶原纤维分布,对40个随机视野分析后得到其天狼星红染色阳性区域约占视野下总面积的0.13±0.01%(5周龄)和0.18±0.02%(17周龄)；5周龄SHR大鼠心肌胶原纤维占视野下总面积的0.15±0.01%,与同周龄WKY大鼠相比无显著差异；17周龄SHR大鼠心肌胶原分布较同周龄WKY大鼠明显增多,约占总面积的2.93±0.26%(P<0.001)。4.大鼠心肌超微结构观察：电镜下可见5周龄和17周龄WKY大鼠心肌组织中,肌原纤维含量丰富,排列规整,Z线和明暗带清晰；闰盘结构正常；线粒体沿肌原纤维长轴平行排列,可见均匀的基质颗粒和完整致密的线粒体嵴；细胞核为圆形或椭圆形,核染色质均匀,核仁清晰,核膜平滑完整。5周龄SHR大鼠心肌细胞超微结构尚未出现典型的心肌肥大表现,但肌原纤维排列已出现紊乱,部分区域肌丝溶解,肌小节结构破坏,Z线断裂成波浪状；线粒体数量略增多,排布出现不规整；细胞核及其他细胞器形态基本正常。17周龄SHR大鼠心肌细胞内肌原纤维排列紊乱,肌小节结构破坏,Z线断裂成波浪状,部分区域肌丝溶解消失而被增生的线粒体取代；线粒体形态异常,数量增多且排布紊乱,部分线粒体肿胀,因基质颗粒的缺失出现了电子透亮区,线粒体嵴模糊不清；细胞核肥大、畸形,核膜呈不规则凹陷,染色质聚集成小团块,在核膜内侧尤为显著,核仁较为明显；粗面内质网和高尔基体发达,提示合成分泌功能旺盛,符合心肌肥厚表现。5.质谱分析结果：实验共鉴定出大鼠心肌蛋白506个,5周龄SHR大鼠与WKY大鼠相比差异表达蛋白共7个,其中上调3个,下调4个；17周龄SHR大鼠与WKY大鼠相比差异表达蛋白28个,其中上调17个,下调11个。进一步分析发现,5周龄和17周龄WKY与SHR两组中共同的差异蛋白有3个,分别是：Profilin-1、Myosinlightchainkinase2和MitochondrialNADP+-isocitratedehydrogenase。6.SHR大鼠肥大心肌差异蛋白的功能分析：根据分子功能注释,差异蛋白主要执行结构性分子功能(36.7%),结合功能(30.0%)和催化功能(20.0%)。根据生物过程注释,差异蛋白主要参与细胞过程(18.0%)、代谢过程(16.0%)、生长发育(14.0%)及生物合成(14.0%)4种生物过程。根据细胞成分注释,主要包含细胞组成(47.6%)、细胞器(42.9%)、细胞膜(4.8%)及细胞连接(4.8%)四部分。Panther蛋白种类分析显示差异蛋白主要包含细胞骨架蛋白(33.3%)、酶调节蛋白(13.3%)、结构蛋白(10.0%)和氧化还原蛋白(6.7%)等,细胞骨架蛋白占据的高比例(三分之一)与前面结构性分子功能(36.7%)相呼应,可见细胞骨架蛋白在SHR大鼠心肌肥大病理过程中占据重要地位。7.实时定量PCR检钡Profilin-1的mRNA表达：5周龄SHR大鼠profilin-1mRNA表达水平为同周龄WKY大鼠的1.86倍,表达明显上调(P<0.001)；17周龄SHR大鼠profilin-1mRNA表达水平为同周龄WKY大鼠的2.83倍,表达上调具有显著的统计学差异(P<0.001)。实时定量PCR结果与iTRAQ研究结果一致。8.WesternBlot检测Profilin-1的蛋白表达：与同周龄WKY大鼠相比,5周龄SHR大鼠心肌组织profilin-1的蛋白水平上调了约23.33%,差异具有统计学意义(P<0.05)；17周龄SHR大鼠心肌组织profilin-1的蛋白水平较同周龄WKY大鼠上调了约64.10%,差异具有统计学意义(P<0.01)。Westem-blot结果与比较蛋白质组学研究结果一致。结论1.心脏质量指数、心肌病理学分析以及超微结构观察结果均证实17周龄SHR大鼠心肌肥大模型已构建成功,5周龄SHR大鼠心肌出现早期病理改变,尚未发生心肌肥大。2.作为定量比较蛋白质组学的新技术iTRAQ具有较好的精确性、重复性和定量效果,可用于研究SHR大鼠心肌肥大的分子机制,找到该发病过程的关键蛋白及通路。3.质谱鉴定17周龄SHR大鼠肥大心肌与同周龄WKY大鼠正常心肌的差异表达蛋白28个,其中上调17个,下调11个,经G0分析后发现细胞骨架蛋白在SHR大鼠心肌肥大病理过程中占据重要地位。4.实时定量PCR及Westernblot实验结果均证实SHR大鼠心肌组织中profilin-1的表达水平明显上调,这一方面验证了iTRAQ技术的可靠性,同时为深入研究高血压诱导的心肌肥大的发病机制提供了关键的候选靶点。第二部分profilin-1在高血压大鼠心肌肥大中的作用及机制研究研究背景高血压是心肌肥大的首要致病因素,患者的心脏处于血流动力学超负荷状态时,心肌细胞可感知该种牵张刺激,产生、释放多种细胞因子,这些细胞因子与心肌细胞膜上的相应受体结合后激活多种肥大相关信号级联反应,随后诱导核内原癌基因的转录活化,启动心肌细胞的肥大反应过程。胞膜的功能蛋白、细胞骨架系统和细胞因子间的相互作用共同参与了这一病理生理过程,其中细胞骨架系统是感知力学刺激、将机械应力转化为生化信号的关键组件,研究细胞骨架,尤其是肌动蛋白微丝系统,是深入认识血流动力学超负荷诱导下心肌肥大发生机制的重要切入点。Profilin-1是一种重要的肌动蛋白结合蛋白,可受细胞外信号影响而调节肌动蛋白细胞骨架的动态组装。课题组前期研究提示profilin-1在哇巴因高血压大鼠心肌肥大早期发挥关键作用,且第一部分的蛋白质组学结果揭示自发性高血压大鼠早期肥大心肌中profilin-1的表达较对照组显著升高。因此,本课题将利用自发性高血压大鼠心肌肥大模型,构建腺病毒表达载体,诱导心肌细胞中profilin-1基因的过表达和沉默,综合运用各种病理学组织学染色技术和分子生物学技术研究profilin-1在高血压心肌肥厚病变发生发展中的作用及其可能机制。这些结果将为高血压心肌肥大患者的早期防治提供新靶点,具有重要的学术理论意义和潜在的临床应用价值。研究目的1.自发性高血压心肌肥大模型大鼠体内转染高表达腺病毒载体pAd-profilin-1-IRES-EGFP或干扰腺病毒载体pAd-miR-profilin-1,观察对心肌肥大病变的影响：2.在组织病理学水平、细胞分子水平和超微结构水平研究profilin-1参与高血压心肌肥大发生发展的机制;研究方法1.5周龄自发性高血压大鼠60只,随机分为SHR-C组、SHR-I组和SHR-H组；5周龄健康WKY大鼠20只作为对照组WKY-C组.SHR-C组与WKY-C组大鼠经尾静脉注射阴性对照腺病毒载体3×109PFU/只,SHR-I组大鼠经尾静脉注射干扰腺病毒载体pAd-miR-profilin-13×109PFU/只,SHR-H组大鼠经尾静脉注射高表达腺病毒载体pAd-profilin-1-IRES-EGFP3×109PFU/只。6周后补充注射一次,剂量同第一次,第二次腺病毒注射6周后处死动物留取标本;2.大鼠尾动脉收缩压监测：实验开始前(5周龄)及腺病毒转染后每周末通过大鼠尾动脉血压测量仪监测大鼠尾动脉收缩压,观察profilin-1过表达和沉默后对自发性高血压大鼠血压的影响；3.心脏质量指数测定：大鼠处死后,称量心脏重和左室重,测量主动脉瓣至心尖的距离为左心室长轴。左室与心脏的重量比和左心室长轴均可作为反应心室肥大的指标；4.腺病毒转染效率检测：第二次注射腺病毒后10天,取心肌标本切冰冻切片,荧光显微镜下观察EGFP绿色荧光并拍照,利用Image-ProPlus6.0软件检测每个视野下EGFP绿色荧光细胞占所有心肌细胞的比例,该比值反应腺病毒转染效率；5.病理学检测：对大鼠心肌组织分别进行HE染色和天狼星红染色,观察腺病毒转染后各组大鼠心肌组织病理改变;6.心肌组织超微结构观察：透射电镜技术观察心肌肌丝、肌节、线粒体及小窝等亚细胞结构；7.免疫组织化学染色和免疫荧光染色：应用免疫组织化学染色观察profilin-1在心肌中的定位,免疫荧光染色观察小窝蛋白-3与肌动蛋白微丝的共定位；8.大鼠血清和心肌组织中NO含量测定：应用N0测定试剂盒检测大鼠血清和心肌组织匀浆中NO的含量；9.实时定量PCR检测：取大鼠心肌组织,Trizol法提取RNA,实时荧光定量RT-PCR技术检钡profilin-1、eNOS、小窝蛋白-3mRNA相对表达量；10.Westernblot检测：取大鼠心肌组织,提取蛋白,Westernblot检测profilin-1,eNOS,p-eNOS和小窝蛋白-3的蛋白表达量。研究结果1.各组大鼠血压变化：整个实验过程中(5周龄-17周龄)SHR大鼠血压随周龄增加而升高,且显著高于同周龄WKY大鼠血压；实验末,与SHR-C组相比,SHR-I组血压略下降,差异无统计学意义；与SHR-C组相比,SHR-H组血压略升高,差异无统计学意义。提示profilin-1过表达和沉默对SHR大鼠血压无明显影响。2.心脏质量指数测定：与WKY-C组大鼠相比,SHR-C组大鼠左室重量／心脏重量、左室长轴均明显增加,差异具有统计学意义(P<0.01)；与SHR-C组大鼠相比,SHR-I组大鼠左室重量／心脏重量(P<0.05)、左室长轴(P<0.01)均明显减小,而SHR-H组大鼠左室重量/心脏重量、左室长轴均明显增加(P<0.05)。profilin-1过表达加重SHR大鼠心肌肥大,同时profilin-1基因沉默显著减轻了SHR大鼠心肌肥大。3.腺病毒转染效率检测：采用天空蓝染色屏蔽自发荧光后,各组大鼠心肌组织中绿色荧光细胞占细胞总数的30%-35%,注射生理盐水的WKY大鼠和SHR大鼠心肌组织中检测不到绿色荧光细胞。4.心肌组织病理学分析4.1心肌HE染色：与WKY大鼠相比,SHR大鼠心肌细胞肿胀,部分细胞间排列稀疏、间隙不清,心肌纤维断裂、融合呈波浪状改变；与SHR-C组大鼠相比,SHR-H组大鼠的心肌细胞肿胀更加明显,部分心肌呈灶状与片状坏死,伴有脂肪变性和炎性细胞浸润。相反,SHR-I组大鼠心肌细胞的病理损伤明显减轻。4.2心肌天狼星红染色：与WKY-C组大鼠相比,SHR-C组大鼠心肌胶原分布明显增多,差异具有统计学意义(P<0.001)；与SHR-C组大鼠相比,SHR-H组大鼠心肌胶原分布明显增多(P<0.001),而SHR-I组大鼠心肌胶原分布明显减少(P<0.001)。这些结果表明profilin-1基因的高表达促进高血压诱导的心肌纤维化,而profilin-1基因沉默则有助于减轻心肌纤维化程度。5.心肌超微结构观察：与WKY-C组大鼠相比,SHR-C组大鼠心肌细胞内肌原纤维排列紊乱,肌小节结构浪状破坏,Z线断裂成波,线粒体形态异常,数量增多且排布紊乱,线粒体嵴模糊不清,粗面内质网和高尔基体发达,提示合成分泌功能旺盛,符合心肌肥厚表现；与SHR-C组相比,SHR-H组大鼠心肌超微结构破坏更为严重,大片区域肌原纤维皱缩或崩解,闰盘及Z线不清,线粒体严重肿胀,线粒体嵴断裂甚至消失,内质网扩大,胞核呈早期凋亡形态,大量的胶原纤维增生,可见其将肥大的心肌细胞包绕分隔成束；而SHR-I组大鼠心肌细胞肌原纤维含量较SHR-C组大鼠明显增加,肌节较规则,线粒体轻度肿胀,线粒体内空泡结构较少,心肌细胞核仁清晰,染色质分布均匀,边集现象不明显,内质网扩张不明显,偶有点状胶原纤维增生。6.心肌中肌动蛋白细胞骨架的改变：WKY-C组大鼠心肌中鬼笔环肽荧光染色丰富,而SHR-C组大鼠中染色细弱,提示肌动蛋白细胞骨架含量下降；与SHR-C组大鼠相比,降低profilin-1的表达有助于肌动蛋白微丝结构和含量的保存,而profilin-1高表达则进一步减低肌动蛋白微丝的含量。7.心肌细胞膜上小窝丰度的检测：WKY-C组大鼠心肌中小窝的数量是SHR-C组大鼠的3倍,统计学差异显著(P<0.001),与SHR-C组相比,SHR-H组心肌纤维膜上小窝的数量进一步减低(P<0.001),而profilin-1的沉默则有助于保存SHR-I组小窝的丰度(P<0.001)。实时定量PCR和westernblot的结果显示SHR-H组大鼠心肌小窝蛋白-3的mRNA含量是SHR-C组大鼠的1.66±0.33倍(P<0.05),其蛋白含量是SHR-C组大鼠的1.71±0.21倍(P<0.001)；而SHR-I组大鼠心肌小窝蛋白-3的mRNA含量是SHR-C组大鼠的42.5±2.6%(P<0.01),其蛋白含量是SHR-C组大鼠的33.6±3.2%(P<0.001),小窝蛋白-3的mRNA和蛋白表达水平与肌浆膜上小窝的数量相一致。8.大鼠心肌组织中profilin-1的表达水平及细胞定位：实时定量PCR结果显示,SHR-C组大鼠肥大心肌中profilin-1的mRNA水平较WKY-C组明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01),SHR-H组大鼠心肌组织中profilin-1的mRNA水平较SHR-C组上调了38.10%(P<0.05),而SHR-I组profilin-1的mRNA表达水平较SHR-C组降低了44.29%(P<0.05)；Westernblot结果显示,SHR-C组大鼠肥大心肌中profilin-1的蛋白水平较WKY-C组明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05),与SHR-C组相比,SHR-H组大鼠心肌profilin-1蛋白水平上调了约35.29%(P<0.05),而SHR-I组profilin-1蛋白表达下调了38.24%(P<0.01)；免疫组化图片显示profilin-1蛋白表达在心肌细胞浆内,尤其在核周分布,在血管平滑肌细胞中也见到profilin-1微弱的表达,profilin-1在各组大鼠心肌细胞中的表达水平与westernblot结果一致。9.大鼠血清和心肌组织中N0的含量：与WKY-C组大鼠相比,SHR-C组大鼠肥大心肌中NO含量明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05),SHR-H组心肌组织中NO含量明显低于SHR-C组(P<0.01),而SHR-I组心肌组织中NO含量则明显高于对照组(P<0.05)。同时,我们检测了血清中NO水平,结果显示SHR-I组、SHR-C组和SHR-H组大鼠血清中NO水平无显著差异,这提示profilin-1的高表达和沉默所引起的NO水平的变化是心肌组织内的局部变化而非系统性反应。10.大鼠心肌组织中eNOS表达水平和活性检测：实时定量PCRwesternblot结果显示四组大鼠心肌中eNOS的表达水平无显著差异。进而检测eNOS在Ser1177位点上的磷酸化水平以观察eNOS的活性,结果显示,与WKY-C组大鼠相比,SHR-C组大鼠心肌中eNOS的活性明显减低；与SHR-C组大鼠相比,SHR-H组大鼠心肌中磷酸化eNOS的表达明显降低而SHR-I组的磷酸化eNOS的表达明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论1.自发性高血压大鼠肥大心肌组织中,profilin-1的表达上调,伴随心肌细胞肥大、胶原纤维增生和肌动蛋白细胞骨架受损。2.Profilin-1的过表达通过影响肌动蛋白细胞骨架的组装,干扰心肌纤维膜上小窝的形成,抑制eNOS/N0信号通路的活性而促进高血压诱导的心肌肥大,是高血压心肌肥大的重要发病机制。3.Profilin-1基因沉默主要通过增加心肌组织内肌动蛋白微丝含量,提高肌浆膜上小窝数量,恢复eNOS活性和NO的含量,从分子水平有效抑制心肌肥大的发生发展。
【作者】赵韶华；
【导师】高海青；
【作者基本信息】山东大学，老年医学，2014，博士
【关键词】心肌肥大；iTRAQ；细胞骨架；profilin-1；
【参考文献】
[1]刘坤.新型电解质锂盐双丙二酸硼酸锂衍生物的合成及其电解质性能研究[D].北京化工大学,化学,2013,硕士.
[2]单芙蓉.纳米氧化铝在三聚氰胺甲醛树脂中分散性研究[D].北京林业大学,木材科学与技术,2013,硕士.
[3]鹿明.深化高校体育教育改革促进学生全面发展[J].安徽体育科技.2006(S1)
[4]曾敏.CaCO_3对土壤Cd污染及Cd与酸雨复合污染的治理研究[D].湖南农业大学,环境工程,2004,硕士.
[5]张燕平,张铃,夏莹.商空间理论与粗糙集的比较[J].微机发展,2004,10:21-24.
[6]贺园园,张晋江,赵健伟.石墨烯氧化程度对Ni(OH)_2赝电容性能的影响(英文)[J].物理化学学报,2014,02:297-304.
[7]魏玮.汉赋与汉代风俗[D].西北师范大学,中国古代文学,2013,硕士.
[8]王文龙,胡绍谦,汤震宇.程序化操作在变电站中实现的几个关键问题[J].电力系统自动化,2008,22:66-68.
[9]周竹生.P-SV波和SH波的AVO分析[J].石油地球物理勘探,1993,04:430-438+512.
[10]朱日岭.低价出口原料,高价进口产品中国石墨会成下一个“稀土”吗?[J].中国经济周刊,2014,23:62-63.
[11]左康华.改性石墨烯及其复合材料的制备[D].北京化工大学,材料科学与工程,2013,硕士.
[12]王兆栋,宋玉凤,杜真真,张大伟.石墨烯包覆LaNiO_3作为锂空气电池催化剂的研究[A].中国化工学会储能工程专业委员会（InstituteofEnergyStorageEngineeringoftheChemicalIndustryandEngineeringSocietyofChina）.第一届全国储能科学与技术大会摘要集[C].中国化工学会储能工程专业委员会（InstituteofEnergyStorageEngineeringoftheChemicalIndustryandEngineeringSocietyofChina）:,2014:2.
[13]贾媛.真核肽链释放因子eRF3a/gspt1对大鼠肝纤维化模型的作用[D].河北医科大学,流行病与卫生统计学,2013,硕士.
[14]孙晓鹏.BN公司基于价值管理的业绩评价体系研究[D].中国海洋大学,会计（专业学位）,2014,硕士.
[15]刘娟娟.ZSM-5催化剂上醇氨反应制备吡啶碱研究[D].湖南大学,化学工程与技术,2012,硕士.
[16]郭琦.中外司法鉴定证据规则比较研究[D].西南政法大学,侦查学,2012,硕士.
[17]刘基华.CIMS下计算机信息管理系统的研究与设计[D].电子科技大学,2003.
[18]GileNarcisseFANZOUTCHUISSANG.预测数据空间检索使用概率的隐藏的信息[D].北京交通大学,2012.
[19]叶亮山.含金川铜镍矿粉的镍基复合材料的制备与摩擦磨损性能研究[D].新疆大学,2013.
[20]陈彦君.邓宁—克鲁格效应及其影响因素研究[D].西南大学,应用心理学,2014,硕士.
[21]李慧.三轴光纤陀螺测控装置[D].西安工业大学,通信与信息系统,2014,硕士.
[22]李婕.农业机械类汉语新词语的英译[D].湖南师范大学,翻译（专业学位）,2013,硕士.
[23]韩从亚.齿轮精密成形工艺研究及其CAD/CAPP系统开发[D].武汉理工大学,材料加工工程,2004,硕士.
[24]黄梅芳.N-[（n-丁氧酰基）乙基]马来酰亚胺微乳液的微波聚合和热聚合的研究与表征[D].湘潭大学,高分子化学与物理,2003,硕士.
[25]李倩倩.不同品种威灵仙药材的质量控制研究[D].北京中医药大学,药物分析学,2013,硕士.
[26]李倩倩,张顶立,张成平,房倩.不同埋深下地铁隧道围岩破坏的试验研究[J].现代隧道技术,2013,06:85-93.
[27]雷虹.补阳还五汤复方稳态投料量的研究[D].湖南中医药大学,中药学,2013,硕士.
[28]唐旭利,周国逸,周霞,温达志,张倩媚,尹光彩.鼎湖山季风常绿阔叶林粗死木质残体的研究[J].植物生态学报,2003,04:484-489.
[29]李瑞,陆天扬.碳纳米管与石墨烯作为润滑油添加剂对界面摩擦磨损性能的影响[J].中国科技论文,2015,10:1123-1126.
[30]魏雅芬,郭柯,陈吉泉.降雨格局对库布齐沙漠土壤水分的补充效应[J].植物生态学报,2008,06:1346-1355.
[31]汪汝会.原始缅语的重构[D].北京大学,语言学及应用语言学,2013,硕士.
[32]韩文娟.液压支架三维CAD系统的研究与开发[D].河北工程大学,机械设计及理论,2012,硕士.
[33]隋亮.吉林油田老年人“社区照顾”模式探索[D].长春工业大学,社会工作,2013,硕士.
[34]宋娜.走出沉沦—存在主义对运动参与本真的认识[D].山东师范大学,体育人文社会学,2013,硕士.
[35]朱丽.电针调整迟后性光暗周期转移后节律紊乱的时相特征及其对SCN内PER1蛋白稳定性调控作用的研究[D].成都中医药大学,针灸推拿学,2012,硕士.
[36]刘耀.基于Intranet的企业DSS的开发研究[J].管理信息系统,2001,07:47-51.
[37]叶红.中考物理“新材料”类试题的命题特点浅析[J].新课程(中学),2012,06:154-155.
[38]庞艳丽.定向越野运动员流畅状态维度构成及影响因素研究[D].华中师范大学,体育教育训练学,2013,硕士.
[39]刘晶.我国乡镇政府体制改革研究及可行性路径分析[D].内蒙古大学,公共管理,2013,硕士.
[40]彭易柱.L-精氨酸对獭兔繁殖性能及仔兔免疫功能的影响[D].吉林大学,动物营养与饲料科学,2013,硕士.
[41]周军根.基于DEA的浙江制造业企业信息化效益评价[D].宁波大学,企业管理,2012,硕士.
[42]刘茂盛.中央塔FM五工器故障处理[J].广播与电视技术.2003(03)
[43]李国友.Delta算子系统最优及保成本控制研究[D].燕山大学,控制理论与控制工程,2003,硕士.
[44]杨要理.研究性学习初探[D].华东师范大学,数学教育,2001,硕士.
[45]敬刘凯.浮筏隔振系统自适应前馈控制研究[D].中国舰船研究院,船舶与海洋结构物设计制造,2014,硕士.
[46]陈佳.进口关税总水平下调对人民币汇率影响的研究[D].江西财经大学,世界经济,2013,硕士.
[47]李骏.三电平逆变器数字控制研究[D].浙江大学,2006.
[48]秦艺伟.冲击贯入式潜入器潜头构型参数优化研究[D].哈尔滨工业大学,机械设计及理论,2014,硕士.
[49]肖建国.电子商务环境下的银行信息化建设[J].湖北农村金融研究,2004,02:54-56.
[50]万雅曼.硫铵蒸发结晶的工艺研究与优化[D].华东理工大学,化学工程,2014,硕士.
