脊髓NF-κB/p65介导的神经免疫调节在大鼠佐剂性关节炎发病中的作用及机制研究

【摘要】研究背景类风湿性关节炎(Rheumatoidarthritis,RA),是一种由自身免疫障碍引致免疫系统攻击关节的长期慢性炎症。这种炎症会造成关节变形直至残废,并会因关节疼痛及磨损而失去部分的活动能力,会极大影响患者的生活质量。尽管目前存在很多抗风湿类药物,如非甾类抗炎药(NonsteroidalAntiinflammatoryDrugs,NSAIDs)、慢作用抗风湿药、肾上腺糖皮质激素等,其中新近开发研究的也为数不少,包括肿瘤坏死因子-a(Tumornecrosisfactor,TNF-a)阻断剂、抗CD20单抗、炎性因子的中和抗体[白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白介素-1(interleukin-1,IL-1)]。但是探索类风湿致病机理,并且依此研发相关新药仍是医学界的热点。众所周知,外周组织损伤或炎症会引起脊髓一系列的变化,在关节炎的发生发展过程中,受损的关节组织以及滑膜炎可激活外周伤害性感受器,导致连续和强烈的伤害性信号向上传入脊髓进行调制、整合,这样可能会诱发脊髓的神经免疫反应,从而引起细胞因子、兴奋性氨基酸、环氧化酶-2(cyclooxygenase,COX-2)和前列腺素的产生和分泌,进而导致脊髓伤害性神经元的持续兴奋性增强(即中枢敏化)。有意思的是,脊髓也可以通过信号传递调节外周炎症。有确切证据表明,鞘内给予的相关的一些化合物可减轻外周炎症,这些化合物包括腺苷、色胺、氯胺酮和吗啡、沙利度胺、星形胶质细胞和小胶质细胞抑制剂、促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)p38拮抗剂等。而这些化合物具有一个共同的效应：减少脊髓神经元的兴奋性。另外,一些涉及调节外周炎症的通路已经被阐明,其中包括由交感神经和副交感神经分支组成的自主系统,其支配免疫器官,并可以影响外周的免疫反应。另一种机制即背根反射(dorsalrootreflexes,DRR),可沿躯体传入神经纤维逆向传递信号,促使感觉神经末梢释放神经肽,如血管活性肠肽、P物质和降钙素基因相关肽,从而影响周围炎症。此外,下丘脑-垂体-肾上腺(Hypothalamic-Pituitary-Adrenal,HPA)轴也可以对炎症形成反馈机制,其往往涉及自身免疫和炎性相关疾病,如类风湿性关节炎。核因子-κB(Nuclearfactor-kappaB,NF-κB)是一种关键性的转录因子,参与了中枢神经系统(centralnervoussystem,CNS)许多生理活动或病理过程,如炎症、神经元可塑性、突触传递、学习、记忆和疼痛。NF-κB通过调控众多基因来实现这些过程,其中包括细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α),促炎症酶COX-2和诱导型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase,iNOS),趋化因子和粘附因子。NF-κB的5个亚基已经确定,包括gp105/p50(NF-κB1),p100/p52(NF-κB2)、p65(RelA)、RelB和c-REL,NF-κB的活性形式是这些亚基组成的二聚体。NF-κB最常见和最具特点的二聚体是p50/p65,其广泛表达于中枢神经系统,在基因表达的调节中起着重要的作用。先前的研究表明,外围组织损伤或炎症可活化脊髓NF-κB/p65,我们的早期工作也发现NF-κB/p65与TNF-α共表达于慢性压迫性损伤模型大鼠的脊髓背角,下调脊髓NF-κB/p65的表达可显著降低坐骨神经结扎引起的机械痛觉过敏和热痛觉过敏。这些研究结果表明NF-κB/p65参与了中枢敏化。然而,尚不确定脊髓NF-κ/p65是否也参与了外周炎症的发生发展。本研究首先构建NF-κB/p65基因RNA干扰(RNAinterference,RNAi)’慢病毒载体并转染体外培养的大鼠脊髓神经元和星形胶质细胞,观察其沉默效应以及对IL-1β、TNF-α和COX-2表达的影响。在体建立大鼠佐剂性关节炎(adjuvant-inducedarthritis,AIA)模型,鞘内注射慢病毒重组体,探讨脊髓NF-κB/p65在AIA大鼠外周炎症和痛觉过敏中作用。另外,我们还评估了NF-κB/P65对脊髓IL-1β、TNF-α和COX-2表达的调控作用,以阐明脊髓NF-KB/p65参与外周炎症和痛觉过敏的相关机制。第一部分慢病毒介导RNA干扰对体外培养大鼠脊髓神经元和星形胶质细胞NF-κB/p65基因的沉默效应目的构建NF-κB/p65基因RNA干扰慢病毒载体并转染体外培养的大鼠脊髓神经元和星形胶质细胞,观察其沉默效应以及对IL-1β、TNF-α和COX-2表达的影响方法1.针对大鼠NF-κB/p65基因特异性序列,设计3条NF-κB/p65-siRNA序列及1条阴性对照序列,合成包含各正反义靶序列的互补DNA链,退火形成双链DNA,插入到经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后的pFU-GW慢病毒载体中,PCR筛选阳性克隆,DNA测序鉴定。与慢病毒包装质粒pHelper1.0、pHelper2.0通过lipofectamine2000共转染至包装细胞293T,滴度测定后-80°冰箱保存备用。2.体外培养神经元和星形胶质细胞,用免疫荧光技术进行细胞纯度鉴定。3.慢病毒重组体转染体外培养的大鼠脊髓神经元和星形胶质细胞,观察转染效率。然后用含1μg/ml脂多糖(Lipopolyssacride,LPS)的培养液刺激细胞24h。根据干预条件不同,实验分为6组：阴性对照组、LPS组、LPS+LV-NC组、LPS+LV-shNF-κB/p65-1组、LPS+LV-shNF-κB/p65-2组和LPS+LV-shNF-κB/p65-3组。4.倒置显微镜下观察神经元和星形胶质细胞的形态改变,Real-TimePCR和Westernblotting技术分别检测慢病毒重组体对神经元和星形胶质细胞NF-κB/p65mRNA和蛋白的干扰效率,ELISA法检测培养基中星形胶质细胞分泌的炎性因子(IL-1β、TNF-α)的变化,Westernblot技术检测神经元和星形胶质细胞COX-2的表达情况。结果1.测序结果证实合成的寡核苷酸链插入正确,重组载体构建成功,测定慢病毒滴度为108～9TU/mL。2.培养神经元7d后使用神经元特异性烯醇化酶(neuron-specificenolase,NSE)特异性抗体对其进行纯度鉴定,结果显示85%以上为神经元。培养星形胶质细胞12d后进行传代,传代2次后使用神经胶质酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)特异性抗体对其进行纯度鉴定,结果显示达90%以上为星形胶质细胞。3.慢病毒重组体能成功转染大鼠脊髓神经元和星形胶质细胞,神经元转染效率大于90%,与LV-NC组比较,LPS+LV-shNF-κB/p65-1组和LPS+LV-shNF-κB/p65-2组NF-κB/P65mRNA和蛋白的表达都明显下调,mRNA水平干扰效率达95%(P<0.01),蛋白水平干扰效率达85%以上(P<0.01),而LPS+LV-shNF-κB/p65-3组无明显下调(P>0.05)。相比阴性对照组,神经元的LPS组COX-2表达无明显变化,LV-shNF-κB/p65-1和LV-shNF-κB/p65-2能下调COX-2的表达,而LV-shNF-κB/p65-3则无明显作用。另外,星形胶质细胞转染效率大于85%,与LV-NC组比较,LPS+LV-shNF-κB/p65-1组和LPS+LV-shNF-κB/p65-2组NF-κB/p65mRNA和蛋白的表达明显下调,mRNA水平干扰效率达92%(P<0.01),蛋白水平干扰效率达83%以上(P<0.01),而LPS+LV-shNF-κB/p65-3组无明显变化(P>0.05)。相比阴性对照组,星形胶质细胞LPS组的TNF-α、IL-1β和COX-2蛋白表达明显上调(TNF-α,P<0.01;IL-1β,,P<0.01;COX-2,P<0.05),LV-shNF-κB/p65-1和LV-shNF-κB/p65-2能抑制这种上调效应(P<0.01),而LV-shNF-κB/p65-3组无这种作用。结论成功构建了大鼠NF-κB/P65基因的RNA干扰慢病毒载体,其可使大鼠脊髓神经元和星形胶质细胞的NF-κB/p65基因表达下调,并能抑制LPS导致的TNF-α、IL-1β和COX-2的上调效应。这样为我们下一步动物体内实验奠定了坚实的基础,也为神经系统NF-κB/p65基因功能研究提供一种有效的工具。第二部分脊髓NF-κB/P65对大鼠佐剂性关节炎外周炎症以及痛觉过敏的调控作用目的炎症组织的伤害性刺激可能增加脊髓背角神经元的兴奋性(即中枢敏化),兴奋的神经元可返回信号并调控外周炎症,但是其中的机制尚不明确。最近的一些研究表明,脊髓NF-κB/p65参与了中枢敏化以及相关疼痛。我们的目的是研究脊髓NF-KB/p65是否也参与了大鼠佐剂性关节炎的外周炎症反应及相关痛觉过敏。方法1.构建大鼠佐剂性关节炎模型,在完全性弗氏佐剂(completeFreund’sadjuvant,CFA)注射后第3d或10d,鞘内给予10u1慢病毒重组体(LV-NF-KB/p65或LV-NC)。根据干预条件不同,实验分为8组：对照组、CFA组、CFA+LV-NC(3d)组、CFA+LV-shNF-KB/p65-1(3d)组、CFA+LV-shNF-KB/p65-2(3d)组、CFA+LV-NC(10d)组、CFA+LV-shNF-KB/p65-1(10d)组、CFA+LV-shNF-KB/p65-2(10d)组。2.CFA注射后第14d,使用Westernblot技术、免疫荧光技术以及EMSA技术评估脊髓NF-KB/p65蛋白的表达和转录活性。在CFA注射前1d和注射后第6d、第8d、第10d、第12d、第14d、第16d、第18d以及第20d,对大鼠的疼痛相关行为、足跖肿胀程度进行了评估,在第20d,观察评估大鼠的关节组织病理学改变。此外,在CFA注射后第14d,检测脊髓炎性介质TNF-α,IL-1β和COX-2的表达。结果1.外周炎症上调了脊髓NF-κB/p65蛋白的表达,其主要分布于脊髓背角的神经元和星形胶质细胞,CFA注射后第3d或10d,鞘内注射LV-shNF-KB/p65-1和LV-shNF-κB/p65-2都能下调NF-κB/p65蛋白的表达和转录活性。2.相比阴性对照组,CFA组大鼠的机械痛阈、热痛阈明显下降(P<0.01),而足跖肿胀明显增加(P<0.01),CFA注射后第3d或10d,鞘内给予LV-shNF-KB/p65-1和LV-shNF-κB/p65-2都能显著抑制这些效应(P<0.01)。另外,相比CFA+LV-NC(3d)组,大鼠关节炎症和组织破坏程度在CFA+LV-shNF-KB/p65-2(3d)组显著降低(P<0.01),而LV-shNF-κB/p65-1(10d)组轻微降低,但未达统计学意义(P>0.05)；此外,相比CFA+LV-NC(10d)组,CFA+LV-shNF-KB/p65-1(10d)组和LV-shNF-κB/p65-2(10d)组的关节炎症和组织破坏程度无明显变化(P>0.05)。CFA注射后第3d,鞘内给予LV-shNF-κB/p65-1能下调脊髓TNF-α和IL-1p的表达(P<0.01),但对COX-2的表达无明显作用(P>0.05),而LV-shNF-KB/p65-2能抑制脊髓TNF-α,IL-1β和COX-2表达(TNF-α,P<0.01;IL-1β,P<0.01;COX-2,P<0.05)。CFA注射后第10d,鞘内注射LV-shNF-KB/p65-1能下调脊髓TNF-α的表达(P<0.05),对IL-1β无显著作用(P>0.05),而LV-shNF-KB/p65-2能同时抑制TNF-α和IL-1β的表达(P<0.05),但两者都对COX-2无明显作用(P>0.05)。结论外周炎症上调了脊髓NF-κB/p65蛋白的表达,其主要分布于脊髓背角的神经元和星形胶质细胞。鞘内注射LV-shNF-KB/p65能下调NF-κB/P65蛋白的表达,并且能降低大鼠的痛觉过敏、足跖肿胀以及关节破坏。此外,其也能减少脊髓TNF-α,IL-1β和COX-2的过表达。这些表明脊髓NF-κB/p65在AIA大鼠外围炎症和痛觉过敏的发生发展过程中起着重要作用。因此,抑制脊髓NF-κB/p65的表达对外周炎症性疾病可能是一种潜在的治疗方法。
【作者】罗剑刚；
【导师】傅志俭；
【作者基本信息】山东大学，麻醉学，2014，博士
【关键词】NF-κB/p65；神经元；星形胶质细胞；炎性介质；慢病毒介导RNA干扰；大鼠；佐剂性关节炎；脊髓；

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