Omega-3脂肪酸对大鼠冷保存供肝肝移植后肝损伤保护作用的实验研究

【摘要】研究背景供肝的冷保存缺血再灌注损伤以及由此引发一系列问题诸如移植后早期肝功能不良、原发移植肝无功能、胆道并发症等一直是肝移植研究的热点问题。目前,缺血再灌注损伤的机制仍不十分清楚,一致观点是供肝复流后会激活天然免疫系统并由此引发的局灶性促炎反应。供肝冷保存缺血性损害主要表现为局限性代谢紊乱、实质细胞死亡,并由此引发配体激活、线粒体氧自由基释放。复流后,上述不良因素会在Kupffer细胞、树突状细胞、T细胞、NK细胞和中性粒细胞等多种非实质细胞参与下激活宿主天然免疫系统,进一步加剧炎症反应。外周血中免疫细胞的加入会使这一免疫激活-炎症级联反应持续进展。简而言之,冷保存造成的缺血再灌注损伤是宿主天然免疫系统介导的局限性促炎反应,最终造成肝脏实质细胞的损害。既往研究证实,omega-3多不饱和脂肪酸(以下简称omega-3脂肪酸)能改善胃肠外营养相关性肝病预后；减少炎症介质产生、降低黏附分子的表达,从而起到直接或间接抗炎的作用；预防脂肪肝小鼠缺血再灌注损伤和微循环衰竭的作用；减轻小鼠化学性肝损伤和梗阻性黄疸肝细胞损伤的作用。新近研究证实,omega-3脂肪酸还具有改善大鼠缺血再灌注损伤,促进肝切除后肝再生的作用。虽然最近有omega-3脂肪酸能改善肝移植患者术后肝损伤的临床报道,但其确切作用机制还不十分清楚。众所周知,即使在医学迅猛发展的今天,肝移植过程中冷保存缺血再灌注损伤仍不可避免。因而如何缓解冷保存缺血再灌注损伤,对于改善肝移植患者肝功能、提高手术效果具有非常重要的意义。缺血再灌注损伤时宿主天然免疫系统激活,肝脏非实质细胞释放的各种炎症介质对于免疫激活-炎症级联反应的维持非常关键。目前已明确omega-3脂肪酸能在转基因小鼠化学性肝炎模型中起到抗炎作用。因此,我们设想,首先通过Kamada’‘二袖套法”建立基于精准外科理念下的不重建肝动脉的大鼠原位肝移植模型,找出静脉和胆管最合适的重建方法。并在此基础上建立重建肝动脉的冷保存大鼠原位肝移植模型,探究不同冷保存时间对移植术后近期肝功能和微循环的影响,找出动物实验研究合适的冷保存时间长度。最后对重建肝动脉冷保存肝移植大鼠行术后omega-3脂肪酸干预,以明确omega-3脂肪酸是否对冷保存缺血再灌注后的供肝具有保护作用。第一部分基于精准外科理念的大鼠肝移植模型的建立和评价目的：基于精准外科理念下,建立不重建肝动脉血供的成熟稳定的同品系大鼠原位肝移植模型。并对肝移植模型进行评价,探索二袖套法肝移植中最佳的肝上腔静脉显微缝合方法,最佳的静脉吻合用袖套管和胆管吻合支架管。方法：健康成年雄性SD大鼠,体重250-300g。供受体体重相差≤20g。根据不同的显微缝合方法、袖套和支架类型,将移植组大鼠随机分为3组。第1组：新的肝上腔静脉显微缝合方法+单槽袖套+无损伤胆管支架；第2组：新的肝上腔静脉显微缝合方法+单槽袖套+粗制胆管支架；第3组：肝上腔静脉采用传统的双定点连续缝合法+多槽袖套+无损伤胆管支架。第4组为对照组,实施假手术,仅开腹游离肝周韧带和移植相关血管。记录移植组大鼠各个操作步骤时长、一周和一月的生存率。1月后全部大鼠均在乙醚麻醉下处死,测定其血液肝功能生化指标,并详细解剖肝上、肝下腔静脉、门静脉和肝门部胆管,以明确有无血管扭转、血栓形成和胆汁瘤、胆道梗阻等并发症。P<0.05视为有统计学意义。所有的统计数据使用PASW18.0来分析。结果：新的肝上腔静脉显微缝合方法较传统的双定点连续缝合法速度更快(P<0.05),无术后肝上腔静脉吻合口出血的发生。单槽袖套明显缩短肝下腔静脉和门静脉的重建时间(P<0.05),同时术后血栓也明显减少。新的肝上腔静脉显微缝合方法结合单槽袖套较传统连续缝合与多槽袖套能明显缩短无肝期(P<0.05)。1月后移植组大鼠的肝功能各项指标已恢复正常,与对照组比较无明显差异(P>0.05)。新的胆管支架制作方法能够明显降低大鼠肝移植术后胆道并发症的发生,进而提高了大鼠的一周和一月存活率(P<0.05)结论：新的肝上腔静脉显微缝合方法结合重新设计制作的单槽袖套较传统缝合方法和袖套能够以较小创伤,更简单、迅速、可靠地吻合肝上、肝下腔静脉和门静脉,显著地缩短无肝期,更符合精准外科“最小侵袭,最大脏器保护”的理念。同时,无损伤胆管支架明显较传统粗制支架减弱了对胆管内壁的损伤。因而显著地降低了移植术后胆道并发症的发生。简言之,基于精准外科理念的大鼠肝移植模型创伤更小,耗时更短,模型更稳定、可靠,并发症更少,能够获得更好的远期生存。第二部分冷保存对大鼠肝移植术后肝功能和即时微循环的影响目的：建立成熟稳定、重建肝动脉血供的大鼠冷保存肝移植模型。探讨不同冷保存时间对大鼠肝移植术后肝功能和即时微循环的影响,为进行冷保存肝移植后肝损伤的药物治疗研究奠定基础。方法：实验动物同第一部分。采用第一部分的手术方法建立恢复肝动脉血供的冷保存大鼠原位肝移植模型。根据不同的冷保存时间,将大鼠随机分为3组：第1组,冷保存12h组：供肝使用4℃HTK液灌注并冷保存12h；第2组,冷保存24h组：供肝使用4℃HTK液灌注并冷保存24h；第3组：正常对照组,实施假手术,仅开腹游离肝周韧带和移植相关血管。记录无肝期和供、受体所用手术时间和术后7天受体的一般情况。移植组供肝复流后3、10、20min、对照组完成游离操作后3min分别使用激光散斑灌注成像法对肝脏表面微循环进行测定。移植组大鼠各取10只受体进行7天生存率的比较,其余受体分别于术后1天(24h)、3天、7天处死取血和肝组织标本,每一时间点取6只受体。对照组6只正常大鼠于术后7天处死取血。移植组和对照组检测血清谷丙转氨酶(alanineaminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartateaminotransferase,AST)、,白蛋白(albumin,Alb)、碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)和总胆红素(totalbilirubin,TB)等肝功能指标。肝组织行HE染色,分别从门管区炎细胞浸润、局灶性坏死、胆管增殖、胆管损伤和间质纤维化等5方面对肝损伤程度进行半定量评分。所有大鼠在处死前均经腹壁行肝脏中叶的超声实时弹性成像。所有数据使用PASW18.0软件进行统计分析,P<0.05视为有统计学意义。结果：1.手术时间及术后一般情况：两冷保存移植组大鼠的供、受体手术操作时间无明显差别(P>0.05),无肝期均控制在14min以内。冷保存12h组受体术后恢复较快,麻醉清醒后即刻活动,进饮食水。两组存活受体均未见巩膜、双耳、爪子和尿液的黄染。2.供肝复流后肝脏表面微循环变化：冷保存肝移植大鼠的肝脏表面微循环流量值明显低于正常对照组(P<0.05)。冷保存12h组肝脏表面微循环流量值明显高于冷保存24h(P<0.05)。3.生存率：冷保存12h组明显高于冷保存24h组(P<0.05)。4.血清肝功能指标变化情况：在术后1、3、7天,两冷保存肝移植组大鼠肝功能受损严重,各项指标均明显差于对照组(P<0.05),且同时间点冷保存24h组明显差于冷保存12h组(P<0.05)。随时间延续,两冷保存组ALT、AST呈逐渐下降趋势,ALP则呈先降低后升高,Alb和TB均呈逐渐增高趋势。5.肝组织HE染色半定量评分：冷保存肝移植术后1天肝损伤已非常明显：肝细胞肿胀,近中央静脉的肝细胞空泡变性严重,肝血窦扩张充血,门管区炎细胞浸润,胆管内皮细胞肿胀、坏死。随时间延续,肝细胞肿胀、肝血窦扩张有所减轻,空泡变逐渐缓解,门管区炎细胞浸润和胆管增生较前明显,局灶性坏死有所减轻,胆管损伤有加重趋势,间质纤维化改变不明显。同时间点,冷保存12组在门管区炎细胞浸润、胆管损伤和局灶性坏死等方面的评分均低于冷保存24h组(P<0.05),冷保存12h组的胆管增殖评分则在术后3天和一周低于冷保存24h组(P<0.05)；两组间在间质纤维化上评分差别不显著(P>0.05)。6.超声实时弹性成像：以对照组的肝脏弹性模量值为正常参考值,冷保存肝移植组在术后第1天肝脏弹性模量值即高于正常值(P<0.05),但随时间延续,各组的肝脏弹性模量值变化不大(P>0.05)。冷保存24h组肝脏弹性模量值与冷保存12h组差别不明显(P>0.05),但两冷保存组肝脏弹性模量值始终高于正常值(P<0.05)。结论：1.供肝冷保存会造成肝移植大鼠肝功能的严重损害,且对于胆管细胞的损伤要重于肝细胞。随着冷保存时间的延长,这种肝功能损害随之加重。2.供肝冷保存会造成术后早期的肝脏微循环障碍,随着供肝冷保存时间延长,微循环损害加重。激光散斑灌注成像可以作为供肝冷保存缺血损伤严重程度的早期评价指标之一。3.供肝冷保存12h的大鼠原位肝移植是作为研究冷保存肝移植后肝损伤的比较合适的动物模型。4.超声实时弹性成像可以作为安全、无创地评价肝脏功能的一个参考指标。第三部分Omega-3脂肪酸对大鼠冷保存供肝肝移植术后肝功能的影响目的：明确omega-3旨肪酸对大鼠冷保存肝移植术后肝功能影响并对其作用机制作初步探讨。方法：实验动物及手术方法同第二部分。根据供肝有无冷保存以及术后不同处理,将大鼠随机分为3组：其中第1组实施正常肝移植,第2、3组实施供肝冷保存12h肝移植。术后1-7天,第1、2组予每天生理盐水12ml/kg灌胃,第3组予每天omega-3鱼油脂肪乳12ml/kg灌胃。每组取10只受体进行4周生存率的比较。分别于术后3天、1周、2周、3周和4周处死受体,每一时间点取6只受体,取血和肝组织标本。血清肝功能指标检测和肝组织HE染色半定量评分方法同第二部分。术后各时间点,免疫组织化学方法检测肝组织中Ki-67的表达,Masson染色方法描述肝组织中纤维组织增生的程度。所有受体处死前经腹壁行肝脏超声实时弹性成像,方法同第二部分。另外,对术后3天、1周、2周标本分别使用酶联免疫吸附试验检测血清、实时荧光定量PCR技术检测肝组织中TNF-alpha,IL-6,IFN-gamma和TGF-betal的表达情况。所有数据使用PASW18.0软件进行统计分析,P<0.05视为有统计学意义。结果：1.生存率：正常肝移植组大鼠术后4周生存率高于冷保存组(P<0.05),两冷保存组间生存率无显著差异(P>0.05)2.血清肝功能指标：术后2周内,第2组术后肝功能指标除Alb外明显差于第1、3组(P<0.05),第3组虽较第2组有所改善但仍未达第1组水平(P<0.05)。各组术后2-3周肝功能指标明显好转,并在3-4周趋于平缓。4周观察期末,第1、3肝功能基本恢复,但第2组肝功能指标仍未达正常值(P<0.05)。3.肝组织HE染色半定量评分：同时间点,各组局灶性坏死和间质纤维化评分无差别。胆管损伤则第1组最弱,余两组无明显差别。门管区炎细胞浸润第2组最强,其余两组无明显差别。胆管增殖：术后第1、2周,第1组最弱,其余两组无显著差别；术后第3周第2组最强,其余两组无明显差别。4.肝脏超声实时弹性成像：各组肝脏弹性模量值总体呈逐渐降低趋势,两冷保存组相同时间点无明显差别(P>0.05),但均较正常移植组为高(P<0.05)。5.血清细胞因子水平：各组大鼠血清中TNF-alph、IFN-gama、IL-6和TGF-betal均呈先升后降趋势,术后1周为峰值。相同时间点,第2组术后血清中TNF-alpha、IFN-gamma、IL-6水平最高(P<0.05),第1、3组间无明显差别(P>0.05)。而同时间点各组间TGF-betal无明显差别(P>0.05)。6.肝组织细胞因子mRNA表达情况：肝组织中TNF-alpha,IFN-gamma,IL-6和TGF-betal的mRNA表达强度与血清中的变化趋势类似。相同时间点上,TNF-alpha、IFN-gamma和IL-6各细胞因子mRNA的表达,第2组明显高于其余两组(P<0.05),且1、3组间则无明显差别(P＞0.05),TGF-betal则在各组间无明显差别(P>0.05)。7.肝细胞增殖情况：肝组织Ki-67结果显示,各组术后肝细胞均有不同程度增殖,1周内增殖活跃,其后逐渐减弱。第1、3组间肝细胞增殖程度无明显差别(P>0.05)。前2周内,第2组肝细胞增殖程度明显强于第1、3组(P<0.05)；第3周,第2组肝细胞增殖程度仍强于第3组(P<0.05),第4周各组间差别不显著(P>0.05)。8.肝组织中胶原纤维的检测：Masson染色评分显示,各组术后肝组织中胶原纤维含量呈先升后降趋势,以第2、3周为高。相同时间点,各组胶原纤维含量无差别(P>0.05)。结论：1.与正常移植相比,供肝冷保存12h会显著降低肝移植大鼠术后4周生存率,给予(>mega-3脂肪酸并不能提高其4周生存率。2.供肝冷保存12h肝移植后给予omega-3脂肪酸能在一定程度上改善术后肝功能生化指标,但不能改变其恢复的进程。3.Omega-3脂肪酸通过降低肝组织和血清中TNF-alpha、IFN-gamma和IL-6等促炎细胞因子的表达从而起到抑制炎症反应,缓解缺血再灌注损伤,改善肝功能的作用。Omega-3旨肪酸的使用不增加肝脏纤维化的风险,但对于改善冷保存造成的胆管损伤和胆管增殖效果不明显。
【作者】王洪东；
【导师】董家鸿；徐克森；
【作者基本信息】山东大学，外科学，2014，博士
【关键词】大鼠肝移植；显微外科缝合技巧；静脉重建；胆管重建；精准外科；冷保存；肝损伤；微循环；缺血再灌注损伤；omega-3脂肪酸；

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