生物反应器内应用富血小板血浆构建血管化复合体修复骨坏死的研究

【摘要】股骨头缺血性坏死是由于各种病因破坏了股骨头的血液供应,造成的以股骨头内骨小梁和骨髓坏死为特征的临床常见病,治疗不及时可导致终生残疾,是骨科医生面临的一大难题。骨坏死区的根本问题是成骨祖细胞和血管缺乏,坏死区域骨血管的形成是骨组织修复的前提,各国学者将研究点集中于如何促进骨坏死区骨小梁再生、新生血管形成。富血小板血浆(Platelet-richplasma,PRP)是新鲜全血经离心后获取的自体血小板的浓缩体,含有多种高浓度的生长因子,包括：血小板源性生长因子(plateletderivedgrowthfactor,PDGF)、转移生长因子(transforminggrowthfactor,TGF-β)、血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)、类胰岛素生长因子(insulin-likegrowthfactor,IGF)、表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)等。本项目拟将骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs)与p-磷酸三钙(p-TCP)在灌注式生物反应器(bioreatctor,BO)内复合三维培养,利用PRP的促血管生成、成骨作用,构建高质量的血管化复合体,在MRI实时导引下利用氩氦冷冻消融建立兔股骨头坏死动物模型,同时在MRI导引下通过氩氦刀探针钉道将构建的血管化复合体精确置入到股骨头骨坏死区,通过大体观察、X线检测、组织学评价观察其促进骨坏死修复的作用,期望为临床治疗早期股骨头缺血性坏死提供新的治疗方法。1MRI实时导引下氩氦冷冻消融建立新西兰兔股骨头缺血性坏死模型的实验研究目的探讨MRI实时导引下氩氦冷冻消融建立新西兰兔股骨头缺血性坏死模型的可行性和技术方法方法取2-3月龄的健康的新西兰大白兔48只,静脉麻醉成功后置于开放式0.23TMRI系统中,MRI导引下在大转子下方1cm向股骨头负重区打入2mm导引针,位置满意后置入氩氦刀探针,左侧实验组股骨头氩氦冷冻消融2个循环20分钟,右侧股骨头对照组氩氦冷冻消融1个循环10分钟。分别于术后4周、8周、12周三个时间点行X线检查、大体观察和组织学观察,评估股骨头组织的坏死和修复情况。结果术后4、8、12周股骨头组织学评估,实验组1组股骨头陷窝细胞分别是49.75士3.17,62.06±4.12,48.25±2.76,高于对照组2组39.13±4.48,50.69±3.84,37.50±3.86。术后8周实验组陷窝细胞率为62.06%。术后12周实验组股骨头塌陷率43.7%,对照组股骨头塌陷率12.5%。结论MRI实时导引下利用氩氦冷冻消融成功的建立了兔股骨头缺血性坏死模型,术后4周、8周、12周实验组陷窝细胞率均明显高于对照组。2灌注式生物反应器应用富血小板血浆构建细胞-支架复合体体内血管化评估目的灌注式生物反应器内应用富血小板血浆构建BMSCs-β-TCP复合体并评估其体内血管化情况。方法从兔耳缘静脉抽取新鲜血液,采用二次离心法制备富血小板血浆,与低糖DMEM培养液制备全培养基。体外将兔骨髓间充质细胞与β-磷酸三钙陶瓷复合培养后植入到灌注式生物反应器内,定期更换全培养基,3周后取出复合体,进行扫描电镜检测。将各组不同方式培养的复合体植入到兔皮下组织内,术后12周,取出复合体,免疫组织化学法检测血管标志物血小板-内皮细胞粘附分子(ClusterofDiffrentiation31,CD31).第Ⅷ因子关连抗原(vonwillebrandfactor,vWF)的表达.结果实验组电镜扫描显示β—磷酸三钙(p-TCP)上可见有细胞粘附,细胞伸出伪足和p一磷酸三钙(β-TCP)相连接,骨髓间充质干细胞细胞在β-TCP多孔陶瓷支架上的黏附、伸展和增殖良好。实验组免疫组化结果显示血管标志物CD31.第Ⅷ因子关连抗原(VWF)呈强阳性表现,其他组CD31.vWF的表达较少。结论富血小板血浆富含多种细胞因子,灌注式生物反应器内应用富血小板血浆构建细胞-支架复合体可以明显促进复合体血管化。3灌注式生物反应器内构建血管化BMSCs-β-TCP复合体修复骨坏死的实验研究目的探讨灌注式生物反应内构建血管化BMSCs-β-TCP复合体促进骨坏死修复的作用。方法分别用实验1、2描述的方法建立新西兰兔股骨头缺血性坏死模型和构建血管化复合体。30只兔随机分为六组,A组钉道中不植人任何材料,B组植入β-TCP支架,C组MSCs-β-TCP,D组MSCs-β-TCP+bioreatctor,E组MSCs-β-TCP+PRP,F组MSCs-β-TCP+bioreactor+PRP。将不同方式构建的BMSCs-β-TCP复合体沿股骨头建模制作的钉道植入到股骨头坏死区,术后12周利用大体观察、X线检查和组织学观察评估其促进骨坏死修复的作用。结果术后12周,各组X线检查示：A组、B组均有部分股骨头骨皮质不完整,局部骨密度高；C、D、E组未见有股骨头明显塌陷；F组未见有股骨头塌陷,坏死区骨密度与宿主区骨密度相近。组织学结果显示：A组、B组见较多纤维组织,骨形成少；C、D、E组少量骨形成,骨小梁排列不整齐；F组骨形成量较多,骨小梁排列良好,与正常骨小梁结构相近。结论生物反应器内构建血管化组织工程骨可以有效修复骨坏死,从而为临床治疗股骨头缺血性坏死提供了可行的方法。
【作者】王栋；
【导师】孙水；
【作者基本信息】山东大学，外科学（专业学位），2014，博士
【关键词】生物反应器；氩氦冷冻消融；富血小板血浆；组织工程骨；骨坏死；

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