黄药子抑制胃癌生长转移的实验研究

【摘要】胃癌是全世界范围内发病率较高的恶性肿瘤之一,2008年全球新发胃癌患者近99万例,占全部新发癌症病例8%,死亡近74万,占全部死亡病例10%。目前,在世界范围内GC占肿瘤死亡率的第2位,仅次于肺癌。流行病学调查统计,我国胃癌的发病率2000年居第三位,2004～2007年上升至第二位。2010年中国卫生统计年鉴报告,我国胃癌年死亡率为23.10/10万,是世界平均水平的2倍多。胃癌已成为严重威胁人民群众身体健康、阻碍社会经济发展的重大疾病。目前手术根治是胃癌的主要治疗方式,对于早期胃癌患者术后5年生存率较高,可达90%以上,但绝大部分胃癌在确诊时已处于进展期,丧失手术根治可能,5年生存率仅为11%-40%。西医针对中晚期胃癌主要有根治性或姑息性手术、放化疗及免疫治疗等治疗手段,然而全球范围的中晚期胃癌的西医疗效并不理想,那么,中医药在治疗中晚期胃癌的治疗中就有了相当的发挥余地。因此,继续寻找特异性强、高效低毒的抗肿瘤药物,具有较强的临床和现实意义。近年来,中医药在胃癌的预防及治疗中发挥着较突出的作用,体外多项研究已证实中药抗肿瘤效果确切。临床实践表明,单独应用中药或中药复方治疗胃癌疗效确切,同时能减轻放化疗的毒副作用。黄药子为薯截科植物黄独(DioscoreabulbiferaL.)的块茎,其性寒凉,味苦,具有凉血、消瘿、降火、解毒的作用。黄药子在临床应用广泛,主治多种病症。既往的文献报道,中药黄药子具有强大的抗肿瘤作用,临床报道运用含有黄药子的黄白胃癌汤、抗癌乙片等治疗胃癌、贲门癌和食道癌疗效确切。还有报道称黄药子对肝癌、乳腺癌、宫颈癌、原发性支气管肺癌、淋巴瘤等也有一定疗效。相关研究表明中药抗肿瘤机制包括：抑制原癌基因的表达,促进抑癌基因的表达;调控癌变组织周围环境；诱导癌细胞凋亡；降低胃癌细胞侵袭和转移能力等。但有关黄药子治疗胃癌的具体机制尚不清楚。为探讨上述问题,本研究拟通过观察黄药子对体外培养的胃癌细胞株的增殖、侵袭及转移等恶性生物学行为的影响,初步探讨其作用的分子机制；并建立裸鼠胃癌皮下移植瘤动物模型,观察黄药子对荷瘤鼠的生长抑制的影响。本研究对黄药子治疗胃癌提供科学的理论和实验依据,同时对丰富中医抗肿瘤理论,促进中医临床转化具有重要意义。目的1.通过观察黄药子对体外胃癌细胞株SGC-7901氧化还原能力、生长增殖及转移能力的影响,探讨黄药子抑制胃癌生长转移的分子机制。2.通过观察黄药子对胃癌动物模型肿瘤生长的影响,探讨黄药子的抑瘤效果。方法1.体外培养胃癌细胞,黄药子使用乙醇提取,制成不同浓度溶液。2.分光光度法检测不同浓度的黄药子乙醇提取物对胃癌细胞羟基自由基和DPPH自由基清除率。3.ABTS快速试验检测不同浓度的黄药子醇提取物对胃癌细胞的抗氧化能力及还原能力。4.MTT法检测不同浓度的黄药子醇提取物对胃癌细胞的增殖影响。5.流式细胞术检测不同浓度的黄药子醇提取物对胃癌细胞凋亡的影响。6.Transwell侵袭性检测不同浓度的黄药子醇提取物对胃癌细胞侵袭性的影响。7.建立胃癌裸鼠皮下移植瘤,观察黄药子醇提取物对肿瘤生长的影响。8.ELISA检测胃癌裸鼠外周血中炎性细胞因子的表达情况,观察黄药子醇提取物对炎性细胞因子浓度的影响。所有数据采用SPSS13.0统计软件进行统计。检验显著性水准取α=0.05,以P<0.05为差异有统计学意义。结果1分光光度法测定结果表明：不同浓度的黄药子乙醇提取物具有一定的羟基自由基和DPPH自由基清除率。三种提取物中,浓度2mg/ml,70%乙醇提取物的DPPH自由基清除能力最强,清除率为55.2%；80%乙醇提取物的OH自由基清除能力最高,清除率为51.2%；70%和90%乙醇提取物对OH自由基清除率分别为38.7%和39.6%。2还原能力的测试结果显示：黄药子醇提取物具有较强的还原能力。70%的乙醇提取物还原能力为每1克提取物相当于28.1μmolFe2+,80%的乙醇提取物还原能力为每1克提取物相当于49.3μmolFe2+,90%的乙醇提取物还原能力为每1克提取物相当于35.2μmolFe2+,其中80%的乙醇提取物具有最强的还原能力。3ABTS快速检测试验结果表明：黄药子醇提取物具有较强的抗氧化能力。80%7,醇提取物的清除能力最强,接近72%。70%和90%乙醇提取物的清除率分别为55%和45%。随着时间的推移和浓度增大总抗氧化能力逐渐增加。最低浓度为0.2mg/ml时,其清除率为8%。最高浓度为2mg/ml,清除率为52%。在4min、7min、12min,浓度为0.2、0.4、1.0mg/ml时,清除率稳步上升。当浓度分别为1.4、1.8、2mg/ml时,自由基清除率变化均不明显,般在55%和67%之间波动。4MTT法细胞增殖实验结果显示：不同浓度乙醇黄药子提取物溶液均能抑制胃癌SGC-7901细胞的增殖。其中,黄药子70%乙醇提取物溶液0.5、1、2mg/ml抑制胃癌SGC-7901细胞增殖率分别为34.5%、41.2%和45.6%；黄药子80%乙醇提取物溶液0.5、1、2mg/ml抑制胃癌SGC-7901细胞增殖率分别为41.3%、55.8%和62.3%；黄药子90%乙醇提取物溶液0.5、1、2mg/ml抑制胃癌SGC-7901细胞增殖率分别为28.7%、32.4%和34.9%；以2mg/ml的黄药子80%乙醇提取物的抑制率最高,达62.3%。5流式细胞仪细胞凋亡检测结果显示：培养48h后,黄药子醇提取物可明显促进SGC-7901细胞的凋亡,而对照组SGC-7901细胞只出现少量的凋亡。0.5、1和2mg/ml黄药子70%乙醇提取物处理的SGC-7901细胞凋亡率从空白对照组的(3.81±1.56)%分别上升至(5.36±1.85)%、(10.31±2.46)%(P<0.05)和(18.54±3.26)%(P<0.01)；0.5、1和2mg/ml黄药子80%乙醇提取物处理的SGC-7901细胞凋亡率分别为(6.62±1.15)%、(14.27±2.28)%(P<0.05)和(25.07±4.21)%(P<0.01),并呈一定浓度依赖性。0.5、1和2mg/ml黄药子90%乙醇提取物处理的SGC-7901细胞凋亡率分别为(5.65±1.63)%、(11.81±2.75)%(P<0.05)和(20.32±3.54)%(P<0.01)。6Transwell侵袭性检测结果显示：人胃癌SGC-7901细胞分别与0.5、1、2mg/ml80%黄药子醇提取物溶液共培养24小时后,细胞侵袭数目与空白对照组相比,呈降低趋势。高倍镜下对穿过下室面的细胞数进行计数,对照组为94.36±9.51个,0.5mg/ml黄药子80%乙醇提取物组为67.52±7.48个,1mg/ml黄药子80%乙醇提取物组为51.24±6.51个,2mg/ml80%黄药子醇提取物组为38.59±5.43个,与对照组比较,0.5、1、2mg/ml80%黄药子醇提取物可以抑制人胃癌细胞株SGC-7901的侵袭(P<0.05),且呈剂量依赖关系。7建立裸鼠胃癌皮下移植瘤模型情况将瘤块植入裸鼠皮下后,生长至第7天,形成局部可测量瘤灶,造模成功率100%；皮下肿瘤前期生长较缓,外观呈球形或半球形,初起可活动,日渐变硬,肿瘤大小不一,观察期内各组裸鼠均未出现明显消瘦及体重下降。8黄药子醇提取物对荷瘤裸鼠肿瘤体积的影响治疗结束后,黄药子高剂量组瘤体积小于模型组(P<0.05),5-FU组和黄药子低剂量组瘤体积与模型对照组比较无统计学差异(P>0.05),黄药子高剂量组与低剂量组及5-FU组比较,差异均无统计学意义(P>0.05),5-FU组和黄药子低、高剂量组三者对瘤体积的抑制率分别为25%、17.86%和39.29%。9黄药子醇提取物对荷瘤裸鼠肿瘤质量的影响与模型对照组比较,5-FU组和黄药子高剂量组裸鼠移植瘤质量显著下降(P<0.05),黄药子不同剂量组之间瘤质量比较差异无统计学意义(P>0.05),高低剂量黄药子组瘤质量与5-FU组比较,差异亦无统计学意义(P>0.05),5-FU组和黄药子低、高剂量组对荷瘤裸鼠瘤质量的抑制率分别为37.5%、25%和43.75%。10黄药子醇提取物对裸鼠皮下移植瘤外周血血清IL-8水平的影响与模型对照组比较,5-FU组和黄药子组裸鼠血清IL-8水平显著下降(P<0.05)；黄药子高剂量组血清IL-8水平明显低于低剂量组(P<0.05)。11.黄药子醇提取物对裸鼠皮下移植瘤外周血血清sICAM-1水平的影响与模型对照组比较,5-FU组和黄药子组裸鼠血清sICAM-1水平显著下降(P<0.05)；黄药子高剂量组血清sICAM-1水平明显低于低剂量组(P<0.05)；黄药子高剂量组血清sICAM-1水平明显低于5-FU组(P<0.05)。结论1.黄药子醇提取物对人胃癌SGC-7901细胞具有一定的自由基清除能力和较强的抗氧化还原能力；2.黄药子醇提取物能抑制人胃癌SGC-7901细胞的增殖,并诱导人胃癌SGC-7901细胞的凋亡;3.黄药子醇提取物能降低人胃癌SGC-7901细胞的侵袭性；4.黄药子醇提取物能体内抑制人胃癌裸鼠皮下移植瘤的生长,可能与下调侵袭转移相关炎性因子(IL-8和sICAM-1有一定关系。
【作者】陈翔；
【导师】李杰；
【作者基本信息】山东大学，外科学（专业学位），2014，博士
【关键词】黄药子；胃癌；增殖；凋亡；移植瘤；侵袭性；IL-8；sICAM-1；实验研究；

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