S100B在胶质瘤生长中的作用及其机制的研究

【摘要】胶质瘤是神经外科中最常见的恶性肿瘤,它是神经上皮性肿瘤,常由间质细胞组成,其生长特点为浸润性生长,常见的临床症状为颅内压增高及相应生长部位的局灶性症状,该肿瘤的恶性程度高,与周围组织界限不清,生长迅速且具有很强的侵袭性,目前为止仍无法手术完全切除,术后容易复发,且由于血脑屏障的存在致使化疗的效果不佳。目前可用的治疗方法有手术治疗、放疗、化疗、免疫治疗、基因治疗、微波治疗等综合治疗方法。胶质瘤患者的预后非常差,中位生存期为18个月。S100B是钙结合蛋白多基因家族中的一员,它在细胞的代谢、增殖和移动中发挥了一定作用。研究表明神经系统中的星形细胞释放出毫摩尔级别浓度的S100B蛋白至细胞外间隙,从而促进轴突的生长并能保护神经元。在肿瘤、炎症等病理条件下,S100B蛋白的浓度上升至微摩尔浓度级别,从而刺激小神经胶质细胞和星形细胞,并能升高前炎性细胞因子的表达。S100B蛋白在大部分恶性胶质瘤中过度表达。目前常认为肿瘤的发生是因为肿瘤抑制蛋白p53的功能受到抑制以及通过刺激有丝分裂激活酶Ndr和Akt来调节细胞增殖及分化。S100B蛋白的浓度与胶质瘤的生长及星形细胞的功能有关系。中枢神经系统中S100B蛋白可能会有利于星形细胞的分化并可能促进星形细胞的活化和运动。但是,S100B在胶质瘤发生中的所起的作用,以及S100B对该作用的机制,目前为止还没有广泛的研究,还是不清楚。目的目前关于S100B蛋白在胶质瘤发生、生长中的作用还没有进行广泛的研究。此前研究显示即使低浓度的S100B蛋白亦可激活Stat3从而调节肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的活性。因此,我们假设：S100B蛋白的表达同样可以通过调节体内TAM的活性来促进胶质瘤的生长增殖。本实验通过使用多种试验手段观察S100B蛋白在胶质瘤生长方面的作用以及S100B在肿瘤生长及血管生成时起作用的途径,从而明确S100B在胶质瘤发生及生长中所起的作用,初步阐明S100B通过何种途径促进胶质瘤生长的机制,并探讨在胶质瘤治疗方面以S100B蛋白为靶点,使用S100B抑制剂来抑制肿瘤生长的潜在的利用价值。方法：1.稳定转染的三种细胞系：使用细胞转染及筛选后稳定表达并传代的三种细胞系。2.S100B对胶质瘤生长的作用：2.1S100B在体外试验时对GL261细胞系生长的影响：使用Westernblot及其蛋白定量和ELISA检测S100B在三种细胞系中的表达情况,用细胞计数法及流式细胞术检测三种细胞系细胞在体外培养的生长速度。2.2S100B在胶质瘤动物模型中对GL261细胞生长的影响：使用荧光免疫组织化学、实际肿瘤大小的比较、三种细胞系小鼠生存试验、流式细胞术、活体动物血管成像来检测S100B在动物模型中对肿瘤生长的影响。2.3抑制S100B对胶质瘤动物模型中GL261细胞生长的影响：使用Westernblot、小鼠生存试验、流式细胞术、流式细胞术检测S100B受抑制时对胶质瘤生长的影响。2.4S100B对炎症及巨噬细胞浸润情况的影响：使用NF-κB检测、RT-PCR及流式细胞术检测S100B对炎症及巨噬细胞浸润情况的影响。3.RAGE在胶质瘤生长的影响：使用Westernblot、荧光免疫组织化学、RT-PCR、流式细胞术检测RAGE在胶质瘤生长中的作用。4.CLL2在胶质瘤生长中的影响：使用ELISA、Westernblot、荧光免疫组织化学、RT-PCR检测CLL2在胶质瘤生长中的影响。5.S100B与胶质瘤的联系：使用恶性肿瘤基因图谱分析来检测S100B与肿瘤亚型的关系及在各个亚型中S100B与CLL2的关联性。结果：1.S100B可以促进体内胶质瘤的生长我们发现三种不同S100B表达水平的GL261细胞系在体外生长的增值速率相似。与此相反,这三种细胞系在体内肿瘤的生长速率及肿瘤血管生成速度是有区别的。2.S100B促进了炎症的发展并增强了巨噬细胞对胶质瘤的渗透能力体内S100B高表达的细胞系S100Bhi-肿瘤表现出了增强的炎性反应,流式细胞术同时证明巨噬细胞(CD11bhi8hCD45hi8h)在S100Bh-和S100Bwt中的表达要高于在S100B1ow中的表达,并发现通过抑制S100B可以减低TAM的浸润并可以延长载胶质瘤动物的生存期。3.S100B诱导的RAGE活化S100B在肿瘤中可以诱导RAGE活化,S100B是唯一一个在肿瘤中可以刺激RAGE表达的RAGE配体,但RAGE可能不是S100B介导的TAM浸润模型中的必须品。4.趋化因子的产生体内体外实验表明S100B表达的上调导致了GL261细胞中CCL2的诱导的发生,并且它是TAM浸润入胶质瘤组织过程中的决定因素。相反的是,这三种细胞系分泌的CXCL12却没有明显的区别。另外相关的一个细胞系也证实CCL2的表达随S100B的增加而增加,并且同时增加的还有TAM的浸润。5.与人类胶质瘤的关系为了评价我们发现的结果与人类胶质瘤之间的联系,通过分析TCGA中开放数据库提供的数据,S100B的表达与原神经性、神经性、经典型胶质瘤有正相关关系,并发现S100B的表达在所有TCGAHTU133Aarray中与CCL2的表达有关系,并且在神经元型及原神经元型胶质瘤亚型中有更强的关联。以上结果肯定了S100B在一些胶质瘤亚型中可能是通过上调CCL2的表达来进行TAM浸润这一过程。结论：体内、体外实验证实：胶质瘤中S100B很可能是通过CCL2的上调表达及TAM的化学趋化性来促进了肿瘤的生长。胶质瘤可以分泌S100B,其可以通过影响趋化因子CCL2的化学趋化作用吸引骨髓源性的巨噬细胞从而达到促进胶质瘤生长。因此胶质瘤中S100B与CCL2在巨噬细胞的浸润及胶质瘤的生长中起着十分关键的作用。这为胶质瘤治疗中S100B抑制物提供了一个潜在的应用机会。
【作者】王华卿；
【导师】庞琦；
【作者基本信息】山东大学，外科学，2014，博士
【关键词】S100B；CCL2；TAM；胶质瘤；胶质瘤动物模型；

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