多壁碳纳米管的表面化学修饰调控细胞自噬的研究

【摘要】由于具有独特的理化性质,纳米材料在航空航天、能源、建材、涂料、催化、环境保护、电子器件、生物医药以及消费品等领域有着广泛的应用。与纳米材料相关的产品正加速走进人们的日常生活。纳米材料的广泛应用加大了其与人体接触并进入人体的几率,因此研究纳米材料的生物学效应,即其对基本生命过程的影响,从而更好地评价其生物安全性就显得十分必要和紧迫。自噬,意为自体吞噬,是利用溶酶体机制降解细胞内物质成分的过程的统称。其广泛存在于从低等的酵母菌到高等的哺乳动物细胞等所有真核细胞中,是与泛素-蛋白酶体机制并列的另一种降解途径。通常情况下,细胞保持低水平的基础的自噬活性来应对代谢压力、衰老或破损的细胞器、错误折叠或聚集的蛋白来维持细胞内环境的稳定。在如饥饿、能量缺乏等代谢胁迫的情况下,自噬会被上调,短期内为细胞提供必要的营养和能量,应对生存压力。而如果细胞长时间处于较高的自噬水平,就会引起自噬性细胞死亡。另外,越来越多的研究表明自噬过程的缺失或者紊乱与包括癌症、神经退行、II型糖尿病、粥样动脉硬化等很多疾病的发生和发展都有密不可分的复杂关系。鉴于细胞自噬的复杂性,适当的对自噬进行调控,趋利避害,最大限度地利用它进行疾病的治疗在近年来得到研究人员越来越多的关注。纳米材料作为一种新型的自噬诱导剂,其对自噬的影响越来越得到人们的关注。由于自噬本身在生物系统中作用的复杂性,纳米材料与细胞自噬的关系也相应得存在着两面性。一方面,许多纳米材料可以诱导自噬,这就对原有的小分子自噬诱导剂形成了有益的补充；另一方面,纳米材料可能会干扰溶酶体功能造成自噬过程的阻滞,从而带来细胞毒性,为纳米材料的应用带来不必要的副作用。因此通过适当的手段对纳米材料进行修饰,从而可控地调节自噬的程度就显得十分必要。我们对包含MWCNT-COOH在内的共81种具有不同表面修饰的MWCNT库的细胞自噬诱发能力进行了评估,结果发现不同表面修饰分化了MWCNT的自噬诱发能力。通过量化自噬小体的个数,将81种不同表面修饰的MWCNT的自噬诱发能力分成了4类。包含羧基在内的7种多壁碳纳米管具有极强的自噬诱导能力,而也有7种碳管因为适当地修饰而丧失了自噬诱导能力,其他碳管的自噬诱导能力则介于上述两个级别之间,分别具有较弱或较强的自噬诱导级别。因此,表面修饰成功地分化了诱导自噬的能力,并且这种能力不局限于单一细胞性。我们还使用计算化学的手段PharmacophoreQuery对碳管表面分子结构与自噬诱导能力之间进行了构效关系的分析,结果发现胺基和羰基这两种氢键受体及其相对位置是诱导自噬的关键基团。在具有最强自噬诱导能力的三种碳管都含有这两种基团,且它们都处于相同的平面内,而在丧失自噬诱导能力的三种碳管中,上述两种基团都发生了一定程度的位移,这可能是由于大的吸电子芳香环的引入造成的。这些发现为今后有目的地设计碳管表面配体,对自噬进行可控的调控提供了一定的理论基础。在分子层面研究小分子或纳米材料诱发自噬的机制是当前自噬研究领域的前沿。我们使用免疫印迹的方法对强自噬诱导级别的碳管进行自噬通路mTOR的检测后发现,7种最强自噬诱导级别的碳管诱发自噬的通路也发生了分化。我们选取mTOR依赖的MWCNT-COOH和另一种与其自噬级别接近的mTOR非依赖的MWCNT41进行更深入的机制研究。电镜是判断自噬发生的金标准,TEM观察到两种碳管处理后的细胞中都有自噬小体的生成,且部分自噬小体内还包裹有碳管,针对LC3B的免疫印迹实验也表明,两种碳管以剂量依赖的方式诱导HEK293细胞产生自噬。随后我们排除了两种碳管表面配体解离从而诱发自噬的可能。通过AnnexinV/7-AAD双染实验及caspase3的免疫印迹实验排除了两种碳管诱导凋亡的可能性。采用具有荧光信号的FITC-BSA分子标记的碳管处理细胞,发现两种碳管在多个时间点具有相似的细胞摄入量。使用Fluo-3AM钙离子荧光探针检测碳管处理后的细胞发现,两种碳管在低浓度(25μg/mL)和高浓度(100μg/mL)时均没有引起细胞内游离钙离子浓度的改变,从而排除通路不同是由于二者对胞内游离钙离子浓度影响的不同带来的。透射电镜观察到两种碳管在细胞内具有相似的亚细胞定位,排除细胞定位不同造成的影响。自噬相关基因PCR阵列实验显示,两种碳管在对IGF-1和IFNA2的表达上发生了显著的不同。结合现有对自噬的认识及课题组前期在碳管的细胞生物学机制等方面的探索,我们推测两种碳管由于表面修饰的不同结合在不同的细胞表面受体上,从而引起了不同的下游自噬通路。MWCNT-COOH通过IGF1R/mTOR/p70S6K通路引起自噬,而MWCNT41则通过IFNA2R干扰了IFNA2的表达,从而引起自噬。我们的研究对调控纳米材料的自噬进行了新的尝试并取得了一定的成果并且为今后合理地对纳米材料进行修饰提供了一定的理论基础。另一方面,我们发现表面不同修饰的纳米材料可以分化其自噬诱导途径,并且对潜在的机制进行了较为深入的探索,从而加深了现有关于纳米材料与自噬诱导关系的认识。
【作者】吴岭；
【导师】闫兵；
【作者基本信息】山东大学，分析化学，2014，博士
【关键词】多壁碳纳米管；表面修饰；mTOR；自噬；组合化学库；信号通路；

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