电针对脑缺血再灌注大鼠脑皮质局部血流量和血管新生的影响研究

【摘要】目的缺血性脑血管病（Ischemiccerebrovasculardisease,ICVD）以高发病率、高死亡率、高致残率和高复发率为特点，现已成为威胁人类健康的三大杀手之一。目前对ICVD研究最多的就是缺血后血流再灌和脑组织血管新生之间的联系。虽然缺血后血流的再灌注可挽救濒临梗死的神经细胞，但也会加重神经细胞损伤而导致其死亡。脑缺血后神经细胞的修复不仅和细胞因子、血氧供应有关，更取决于缺血区血管新生的程度。因为血管新生能影响脑缺血再灌注后侧枝循环的建立，进而为神经细胞的修复和神经功能的重塑创造良好的微环境。微血管内皮细胞是组成血管的基本单位，血管新生的主要表现是微血管内皮细胞的变化，包括形态的改变和数量的增多。血管内皮细胞的增殖直接引发了新生血管密度的增加，也为缺血脑组织血流的再灌提供了基础，而缺血局部脑组织血流再灌量的多少又是评价新生血管的成熟度最直观的指标。基于针灸对缺血性脑损伤的多水平、多靶点的保护作用，观察针灸对脑缺血后脑组织血流复灌和血管新生两者之间关系的影响可以更好地研究针灸防治脑缺血的作用机理，更确切地把握针灸治疗脑缺血的介入时机。促红细胞生成素（EPO,erythro-poietin）是目前有关促血管新生最热门的细胞因子，它能迅速透过血脑屏障而不增加其通透性、抑制炎症反应、保护神经元，还能通过激活其下游JAK2/STAT5分子信号通路有效作用神经血管单元保护受损脑组织。但脑缺血后随着缺血再灌注时间的延长，脑组织自身表达的EPO基因和蛋白都会有所变化，电针对不同时间段、不同缺血区域的脑组织中EPO的表达有不同程度的影响。脑缺血后细胞因子的表达促进了JAK/STAT信号通路中JAK蛋白和STAT蛋白的磷酸化，电针通过对JAK1/STAT3分子信号通路的调控作用来抑制炎症反应、诱导细胞凋亡、减轻脑损伤。而JAK2/STAT5分子信号通路是目前研究出与血管新生有关的一条分子信号通路，在脑缺血再灌注后予以电针干预而出现的血管新生现象是否与激活JAK2/STST5信号通路有一定的关系也是本研究的目的之一。因此本研究以局灶性脑缺血再灌注大鼠为研究对象，通过观察电针对局灶性脑缺血再灌注大鼠缺血脑皮质局部脑血流量变化和微血管内皮细胞的影响，及脑皮质中EPO及其下游相关分子信号通路P-JAK2、P-STAT5在此过程中表达的变化。从而探讨电针治疗缺血性脑血管病可能的作用时机、作用靶点和作用机制。方法将SD大鼠100只随机分为正常对照组10只、假手术组10只，模型组和电针组又分别按缺血再灌注12h、24h、48h和72h分为四个亚组，每个亚组10只。除正常对照组外，假手术组仅分离血管而不插线栓，模型组、电针组两组大鼠参照Longa报道的线栓法，加以改进，制备MCAO脑缺血再灌注模型。根据Zea-Longa的5级评分标准对实验动物神经障碍进行评分，只有神经功能障碍在1级以上的大鼠才能保留下来算作造模成功。电针组造模后采用电针双侧“曲池”、“足三里”穴进行干预，其余组不予以任何干预。采用HE染色以光镜下观察各组大鼠缺血局部脑皮质病理形态的变化；同时用激光多谱勒血流仪检测各组大鼠实验前、缺血再灌注12h、24h、48h和72h后局部脑组织血流量的变化；免疫荧光染色法检测缺血局部脑皮质微血管内皮细胞数目变化情况，并将各组大鼠试验后缺血局部皮质血流值与微血管内皮细胞增殖数目进行Pearson相关性统计分析；免疫组化S-ABC法检测不同时间点大鼠脑缺血皮质中EPO蛋白表达变化；RT-PCR法观察不同时间点大鼠脑皮质中EPOmRNA表达情况；WesternBlotting法检测大鼠脑皮质中P-JAK2、P-STAT5蛋白含量的变化情况。结果（1）光镜下观察发现：正常组和假手术组的大鼠脑皮质形态正常、染色均匀，组织形态结构清晰致密，假手术组的大鼠脑皮质仅见极少量炎性细胞。模型组和电针组的大鼠脑皮质均出现不同程度的损伤，可见组织结构紊乱，间质水肿，微血管周围间隙增宽、微血管管腔变形，部分微血管扩张；神经元变形、坏死，炎性细胞和胶质细胞渗出。但电针组大鼠缺血脑皮质的损伤较模型组的明显减轻，电针能有效减轻脑缺血再灌注后大鼠缺血脑皮质损伤，改善受损脑组织结构紊乱及水肿程度，减小缺血面积，减少坏死细胞数量及减轻细胞变性程度，对受损区域微血管有保护作用。经激光多普勒血流仪检测发现：正常对照组和假手术组的大鼠缺血脑皮质局部rCBF在实验前后几乎没有变化，模型组和电针组两组大鼠缺血脑皮质局部rCBF在实验前后均有不同程度降低，但随着缺血再灌注时间的变化，两组大鼠缺血脑皮质局部rCBF又有升高的趋势。电针能明显增加缺血再灌注后大鼠脑皮质局部血流量，除再灌注24h外，电针组比模型组在各时间点的rCBF均高，且呈显著性差异（P<0.05），特别是在再灌注72h最为明显（P<0.01）。（2）荧光显微镜下观察发现：实验前后，正常对照组缺血局部脑皮质微血管内皮细胞数目无变化，假手术组大鼠缺血局部脑皮质可见极少量微血管内皮细胞增殖，与正常对照组的比较无统计学差异（P>0.05）。脑缺血再灌注后，模型组和电针组两组大鼠局部脑皮质微血管内皮细胞会出现一定程度的增殖，随着缺血再灌注时间的延长，其在脑缺血再灌注12h开始增加，24h持续上升，48h到达峰值，且一直持续到再灌注72h;除再灌注12h外（P>0.05），电针组再灌注24h、48h和72h的微血管内皮细胞增殖数目均多于模型组（P<0.05，P<0.01）；将各组大鼠试验后缺血局部皮质血流值与微血管内皮细胞增殖数目进行Pearson相关性统计分析得出：模型组和电针组两组大鼠局部脑血流量与微血管内皮细胞增殖数目呈正相关,说明随着缺血时间的延长和局部脑血流量的增加，微血管内皮细胞数目也增加。（3）光镜下观察可见：实验前后，正常对照组缺血局部脑皮质EPO蛋白的表达无变化，假手术组仅见极少量EPO蛋白的表达，与正常对照组的比较无统计学差异（P>0.05）。脑缺血再灌注后模型组和电针组两组大鼠局部脑皮质中EPO蛋白有不同程度的表达，其在再灌注12h开始增加，24h到峰值，48h开始下降，一直持续到再灌注72h。电针组与模型组比较，除再灌注12h外（P>0.05），其余各时间点EPO蛋白含量均多于模型组（P<0.05）。通过RT-PCR检测方法可以看出：实验前后，正常对照组缺血局部脑皮质EPO蛋白的表达无变化，假手术组仅见极少量EPOmRNA的表达，与正常对照组比较无统计学差异（P>0.05）。脑缺血再灌注后模型组和电针组两组大鼠局部脑皮质中EPOmRNA的水平出现不同程度的变化，其在再灌注12h开始增加，24h到峰值，48h开始下降，一直持续到再灌注72h。电针组与模型组比较，各时间点EPOmRNA表达均多于模型组（P<0.05、P<0.01）。（4）通过WesternBloting蛋白印迹结果显示：实验前后，正常对照组和假手术组大鼠脑皮质中P-JAK2和P-STAT5蛋白含量在实验前后变化不大，两组之间比较无统计学差异（P>0.05）。脑缺血再灌注后各组大鼠局部脑组织中P-JAK2和P-STAT5蛋白含量均有不同程度的变化，都在脑缺血再灌注12h开始增加，24h持续增加，48h到达高峰，72h开始下降；再灌注12h和72h电针组大鼠脑皮质P-JAK2蛋白含量较模型组的多，其差异有统计学意义（P<0.05），而再灌注24h和48h电针组大鼠脑皮质P-JAK2蛋白含量与同时间点模型组的比较，两组间无明显差异（P>0.05）；同时电针组比模型组各时间点的P-STAT5蛋白含量表达多，且有统计学意义（P<0.01）。结论电针能有效提高脑缺血再灌注大鼠局部脑组织血流量，增加缺血再灌注后局部脑皮质微血管内皮细胞的数量以促进微血管新生；同时又能有助于脑缺血再灌注后大鼠缺血脑皮质中EPO蛋白和EPO基因的表达；促进脑缺血再灌注后大鼠缺血脑皮质JAK2/STAT5信号通路中JAK2和STAT5的磷酸化，明显增加P-JAK2和P-STAT5蛋白含量。电针的这些作用明显改善了脑缺血再灌注后缺血局部脑皮质病理形态变化，减轻了缺血局部脑皮质的损伤。
【作者】梁超；
【导师】陈邦国；
【作者基本信息】湖北中医药大学，针灸推拿学，2014，博士
【关键词】脑缺血再灌注；电针；MCAO大鼠；脑血流量；血管新生；促红细胞生成素；信号转导通路；

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