针刺调控下丘脑胰岛素PI3K信号通路改善胰岛素抵抗的机制研究
【摘要】目的:本课题在中医针灸学“治未病”理论的指导下,从外周形态学、糖代谢和脂质代谢水平,及中枢细胞因子水平,研究电针对胰岛素抵抗模型大鼠血清FIN、FBG、BW、FFA、TG、TC,和下丘脑PI3K信号通路相关分子的调节机制,进一步探讨和分析电针对胰岛素抵抗模型大鼠的治疗效应。方法:选用清洁级雄性8周龄Wistar大鼠60只(由湖北省动物疫病预防控制中心提供,动物许可证号:SCXK鄂2008-005,体重180±20g,饲养于湖北中医药大学针灸研究所动物饲养室,(温度18~25℃,湿度45%~55%)。适应性喂养3天后随机分为对照组、模型组、预防组、“双固一通”电针组(简称:电针组)、脑室灌注脑脊液组(简称:脑脊液组),和脑室灌注阻滞剂组(简称:阻滞剂组),每组10只。正常组给予标准饮食(3.8kcal/g,含70%碳水化合物,20%蛋白质,10%脂肪);其余各组采用高脂饲料高脂饲料(总热能为5.4kcal/g,含38.5%碳水化合物,15%蛋白质,46.5%脂肪),由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。喂养8周后,大鼠尾静脉采血检测FPG、Fins,计算胰岛素敏感指数的自然对数(IAI)即1/[FPG(mmol/L)×FIN(mIU/L)]为表示,当模型组大鼠IAI与正常组比较明显降低(P<0.05)时为造模成功。(1)阻滞剂组大鼠称重后,以10%水合氯醛(30mg/kg)腹腔麻醉。将大鼠固定于脑立体定位仪,头顶局部常规备皮、消毒,依照立体定位图谱进行定位,于前囟后0.8mm,在中位颅盖骨处用牙科钻钻一孔直径2mm的孔。以不锈钢导管插入(长18.0mm,外径0.64mm,内经0.39mm)留置;用带帽的不锈钢制导丝(长17.0mm,直径0.33mm),插入已经置入的不锈钢导管内用以封闭导管。用牙科粘合剂与导管固定。手术后6-8小时大鼠可清醒,缝合皮肤,预防感染,将大鼠置于空笼内待其苏醒。术后二日起,将管内芯隔日抽出,用人工脑脊液清洗,以保持不锈钢导管内清洁。注射时,抽出将管内芯,将微量注射器与内径0.3mm的聚氯乙烯导管(自己拉制成)与不锈钢管相连,取wortmannin(50nmol/L,3mg/kg体重),缓慢给药,注射速度维持在1μL/min。注射完毕后留针8-10min,再缓慢退针,以防药物沿针道返流颅外。(2)脑脊液组大鼠称重后,脑室留管的方法与阻滞剂组相同,脑脊液按照Na+145.5ml/L,K+2.8mol/L,Ca2+2.3mol/L,Mg2+2.2mol,Cl-128.5mol/L,HCO-323.lmol/L,H-2Po4llmol/L,葡萄糖0.6lg/L,渗透压289.omosM/L,PH值7.3配置完成,等量灌注,操作方法与阻滞剂组相同。使用0.30×25mm不锈钢毫针,于大鼠关元穴、后三里穴、丰隆穴和中脘穴进行毫针针刺。足三里穴(后三里穴)和丰隆穴直刺入5-10mm,关元穴向剑突方向,同时中脘穴向耻骨联合方向斜刺5-7mm。采用电针治疗仪(HANS-100A型),连续波,频率(2Hz),强度(1mA),通电(10min),同侧足三里穴和丰隆穴连接同一输出的两个电极,关元穴和中脘穴连接另一输出的两个电极。刺激强度根据局部肌肉收缩情况决定。每日电针10分钟,每周5次治疗,总疗程为8周。结果:1.各组大鼠实验开始8thw造模完成时,与正常组大鼠相比较,模型组、预防组、电针组、脑脊液组、阻滞剂组大鼠的BW、FPG、FINS明显升高(p<0.01)。16thw治疗结束后,与正常组大鼠相比较,模型组大鼠的BW、FPG、FINS明显升高(p<0.01);与模型组大鼠相比较,预防组与电针组大鼠BW、FPG、FINS降低(p<0.05);与阻滞剂组大鼠相比较,脑脊液组大鼠BW、FPG、FINS降低(p<0.05)。与正常组大鼠相比较,模型组大鼠的IAI明显降低(p<0.01);与模型组大鼠相比较,预防组与电针组大鼠IAI升高(p<0.05);与阻滞剂组大鼠相比较,脑脊液组大鼠IAI升高(p<0.05)2.实验结果显示,造模完成后模型组大鼠的TC、TG、FFA明显升高(p<0.01);16w电针治疗结束后较,预防组、电针组大鼠TC、TG、FFA降低(p<0.05),与模型组大鼠的TC、TG、FFA检测结果比较,具有显著差异;与阻滞剂组大鼠相比较,脑脊液组大鼠TG、FFA降低(p<0.05),TC值无明显差异(p>0.05)。3.免疫组化实验结果显示,与正常组大鼠相比较,模型组大鼠IRS2IOD值明显降低(p<0.01);电针治疗结束后,预防组、电针组大鼠IRS2IOD值升高(p<0.05)与模型组大鼠相比较具有显著差异;与阻滞剂组大鼠相比较,脑脊液组大鼠IRS2IOD值升高(p<0.05)。4.Western-blot实验结果显示,与正常组比较,模型组、阻滞剂组大鼠下丘脑中PI3Kp110蛋白表达明显减少(P<0.01);与模型组相比较,预防组、电针组、脑脊液组大鼠下丘脑中PI3Kp110蛋白表达明显提高(P<0.05);与阻滞剂组比较,预防组(P<0.01)、电针组(P<0.01)、脑脊液组(P<0.05)大鼠下丘脑中PI3Kp110蛋白表达明显提高。另外,与正常组比较,模型组、阻滞剂组大鼠下丘脑中p-PI3Kp110蛋白表达明显减少(P<0.01);与模型组相比较,预防组、电针组大鼠下丘脑中p-PI3Kp110蛋白表达明显提高(P<0.05);与阻滞剂组比较,脑脊液组大鼠下丘脑中p-PI3Kp110蛋白表达明显提高(P<0.05)。5.Real-timePCR实验结果显示,与正常组大鼠相比较,模型组大鼠下丘脑Akt2mRNA表达明显降低(p<0.01);与模型组大鼠相比较,预防组和电针组脑Akt2mRNA表达升高(p<0.05);与阻滞剂组大鼠相比较,脑脊液组鼠下丘脑Akt2mRNA表达升高(p<0.05)。结论:1.与模型组大鼠相比较,电针治疗可以有效降低胰岛素抵抗模型大鼠的体质量,调节其血糖和空腹胰岛素浓度。2.电针治疗可以有效降低胰岛素抵抗模型大鼠的游离脂肪酸、甘油三酯和总胆固醇的浓度,缓解因胰岛素抵抗引起的脂质代谢异常。3.电针治疗可以调节胰岛素抵抗模型大鼠下丘脑中IRS-2的含量,提高PI3Kp110、p-PI3Kp110的蛋白表达,和Akt2mRNA的基因表达,说明电针可以通过调节PI3K信号通路相关信号分子,从而缓解胰岛素抵抗。
【作者】王静芝;
【导师】王华;
【作者基本信息】湖北中医药大学,针灸推拿学,2014,博士
【关键词】胰岛素抵抗;“双固一通”电针;下丘脑;IRS2含量;PI3Kp110;p-;Akt2mRNA表达;
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