磷酸酯酶SCP1调控c-Myc蛋白去磷酸化及相关生物学功能的研究和SCP1细胞膜定位的发现及其棕榈酰化修饰的研究

【摘要】c-Myc是一类高度保守的、含螺旋环螺旋结构的蛋白,通过与Max蛋白结合形成异源二聚体而结合E-box,而调控基因的转录。c-Myc是一个具有多重功能的蛋白,它可以调节细胞周期,生长,代谢,分化,凋亡,转化,基因组不稳定性以及血管生成。同样c-Myc在生理及病理过程中如细胞分化、干细胞自我更新与分化、脂肪细胞的分化及肿瘤的发生等过程中发挥着重要作用。SCP1是RNA聚合酶Ⅱ的C端结构域多肽的小磷酸酯酶Carboxy-terminaldomainRNApolymeraseIIpolypeptideAsmallphosphatase1。SCP1(又名NLI-IF,CTDSP1)是一个从果蝇到哺乳动物中都高度保守的磷酸酯酶,能够通过识别底物上保守的SP序列而去磷酸化,调控磷酸化的靶蛋白。已报道SCP1能够在非神经细胞中抑制神经基因的表达；能够调控RNA聚合酶的活性而抑制转录。同时也能够稳定Snail蛋白的表达,而在乳腺癌里促进细胞的迁移。尽管近年来SCP1作为肿瘤抑制因子的生物功能得到了广泛的研究,但其抑制肿瘤发生的具体分子机制及其新的生物学功能仍然有待于进一步研究。在本论文中,我们运用生物信息学、细胞生物学、分子生物学的技术筛选鉴定了调控c-Myc蛋白去磷酸化的一种新的磷酸酯酶即SCP1。本课题重点研究了c-Myc蛋白去磷酸化的修饰和其稳定性,从生化、细胞、分子水平上研究了SCP1调控c-Myc蛋白去磷酸化的具体分子机制及新的生物学功能；同时也研究了发现了SCP1定位细胞膜和其细胞膜定位的分子机制。第一部分主要分成以下几章：一、SCP1调控c-Myc62位苏氨酸的去磷酸化修饰我们通过磷酸酯酶库筛选出新的调控c-Myc蛋白Ser62的去磷酸化的磷酸酯酶SCP1,并通过体内,体外去磷酸化实验确定了SCP1能够去c-Myc蛋白Ser62的磷酸化。二、c-Myc的HLH结构和SCP1的C端相互作用的分子机制研究我们通过体内体,外实验证明了c-Myc和SCP1能够结合,并且在内源蛋白也能够相互作用,通过SCP1的缺失突变体,我们进一步研究证明SCP1的C末端能够和c-Myc蛋白相互作用。同时我也对c-Myc蛋白进行了缺失突变,发现c-Myc的C端同样对和SCP1的相互作用至关重要。三、SCP1的磷酸化修饰调控c-Myc影响其蛋白稳定性Ser62磷酸化对c-Myc蛋白的稳定性至关重要,我们通过过表达和Knockdown实验证明,SCP1的去磷酸化修饰导致c-Myc蛋白表达量减弱。而通过之前的实验结果,我们进一步发现SCP1的C末端对其蛋白酶活性至关重要。通过点突变实验,发现SCP1的Thr251和Ser252是影响其酶活性关键氨基酸。四、SCP1介导c-Myc蛋白的去磷酸化并影响肝癌细胞增殖通过对SCP1在小鼠组织表达分布,我们挑选肝细胞和肝癌细胞系发现SCP1和c-Myc的表达是负相关的关系。因此我们进一步在相对高表达SCP1细胞系中KnockDownSCP1,通过CHXPulsechase实验,发现c-Myc表达明显增多：在低表达SCP1的细胞系中过表达SCP1,发现c-Myc蛋白的磷酸化减少,同时通过MTT实验发现存活的细胞也显著减少。综上所述,阐述了SCP1在肝癌中的抑癌基因作用。第二部分主要分成以下几章：一、SCP1细胞膜定位的研究通过免疫荧光实验发现SCP1能够定位细胞膜,并通过生化实验分离细胞膜,从过表达和内源检测SCP1,确定其能定位细胞膜,并通过缺失突变确定SCP1的N端31-55氨基酸是决定其定位细胞膜。二、SCP1棕榈酰化的研究通过生物信息学分析,分析出C44,C45和C47可能是潜在的棕榈酰化修饰位点而定位细胞膜。首先通过点突变和棕榈酰化抑制剂,间接证明SCP1可能发生棕榈酰化,进而我们通过ABE实验和同位素标记实验直接证明,SCP1确实发生棕榈酰化修饰,而使SCPl定位于细胞膜。综上所述,我们运用磷酸酯酶库、通过细胞生物学生化及分子生物学技术、技术成功地筛选并鉴定了调控c-Myc蛋白去磷酸化的一种新的磷酸酯酶SCP1,首次发现了SCP1蛋白对c-Myc蛋白水平的负调控机制。对于进一步理解c-Myc蛋白稳定性及生物功能提供了新的线索和思路。本课题着重研究了SCP1对c-Myc蛋白稳定性的调控,发现磷酸酯酶SCP1能够通过磷酸化依赖的途径,调控促转录因子c-Myc的去磷酸化,在蛋白水平上抑制c-Myc调控的下游基因的表达,在细胞水平上,SCP1抑制了肝癌细胞的增殖。c-Myc在肿瘤发生当中扮演着重要的角色,.发现SCP1对c-Myc蛋白水平的负调控,对于理解肿瘤的发生具有重要意义,可以为治疗肿瘤及其他疾病提供新的靶点。此外,发现并证实SCP1通过棕榈酰化修饰定位于细胞膜,而且这是迄今第一个有文献报道的丝氨酸苏氨酸磷酸酯酶定位与细胞膜的研究,预示SCP1有更多的调控机制来影响肿瘤细胞增殖的进程。
【作者】廖鹏；
【导师】王平；
【作者基本信息】华东师范大学，生物医学，2012，博士
【关键词】c-Myc；SCP1；去磷酸化；肝癌；膜定位；棕榈酰化；

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