介孔材料构建肝素控释的小口径人工血管的实验研究

【摘要】动脉硬化引起的冠状动脉疾病和外周血管疾病是目前威胁人类健康的主要疾患之一,临床主要通过移植血管代替病变的血管进行血管旁路转流治疗。用于移植的血管由于大部分缺乏自体血管而必须应用人工合成代用品,如Dacron和ePTFE血管等。但对于小口径移植血管(内径<6mm)由于血栓性和内膜增生,临床使用具有很低的长期通畅率,最终导致了移植血管临床应用的失败。由于组织工程血管仍处于试验研究的初期阶段,材料表面的肝素化仍具有很重要的意义。肝素是一种强大的抗凝剂,能够阻止血栓形成和内膜增生,目前肝素化方法主要有离子键结合和共价结合,然而各种结合方法都不能保证肝素活性的长期维持和缓慢释放。介孔材料具有很大的比表面积和可调的孔径结构,能够通过介孔的空间限制效应进行药物的缓释,因而近年来成为药物缓释技术的研究热点。我们形成了一个新的策略制备介孔人工血管,改善血管材料的生物性能和肝素的长期缓慢释放达到材料表面的肝素化,提高了材料的抗凝性和生物相容性。全文分为四个部分：第一部分含介孔ePTFE人工血管的构建及其肝素固载目的：制备含介孔ePTFE人工血管,并进行肝素的固载和缓释检验,为进一步的实验提供实验材料。方法：制备介孔溶胶加压灌注于ePTFE人工血管内,形成含介孔人工血管,通过等温氮气吸附实验,SEM及元素分析对其进行表征。介孔人工血管通过肝素溶液渗透法和介孔的吸附效应固载肝素,利用甲苯胺蓝实验和凝血酶失活实验检测肝素的释放曲线和肝素长期活性。结果：成功制备出介孔材料,并原位合成了含介孔硅人工血管,成功的进行了肝素在介孔的吸附和材料的肝素固载。SEM图像下见修饰的ePTFE人工血管具有三维的网状连接结构,介孔硅均匀的分布在ePTFE内部的纤维丝表面和结点周围,整个介孔硅材料贯穿于人工血管壁内外；X-raymapping图像显示介孔硅是沿着人工血管的结点和连接纤维分布,并均匀的分布于人工血管周围和贯穿于整个人工血管。等温氮气吸附实验,发现MBVP-n样品有很大的比表面积(BET),平均孔径都在介孔尺度范围,HMBVP-1,2,3的不同标本呈现孔道尺寸分布和孔径依次增大,而BET比表面积和孔容积依次降低；甲苯胺蓝实验检测相当多数量的肝素吸附到介孔孔道结构中,并能够缓慢的持续从孔道中释放。凝血酶失活实验显示：三个样品HMBVP材料中都能在较短的时间内灭活大部分的凝血酶,长期的缓释后仍能保持肝素活性。结论：本课题成功的构建了肝素固载的含介孔人工血管组织工程血管,并实现了肝素的长期活性和缓慢释放,达到了材料的肝素化。第二部分肝素固载的含介孔人工血管的生物相容性目的：检测构建的肝素固载的含介孔人工血管的血液相容性和组织相容性。方法：通过水接触检测、体外溶血率检测、乳酸脱氢酶细胞毒性实验和血管材料体内种植实验分别检测合成的血管材料的亲水性,对红细胞的破坏性,细胞毒性,植入体内的毒性反应和免疫反应来检测材料的组织相容性。通过凝血功能检测,血小板粘附实验和复钙时间来检测材料是否能够具有抗凝,抑制血小板粘附,检验其血液相容性。结果：水接触实验显示MBVP-1,MBVP-2,MBVP-3样品的水接触角分别为16°、78°、88°,明显的促进了ePTFE人工血管的亲水性能。HMBVP-1,2,3的相应的溶血率为1.2%,1.5%和2.6%,这低于ePTFE所产生的溶血率4.7%。与未修饰的ePTFE为对照,纤维连接蛋白在肝素固载的介孔人工血管上明显的比起对照减少了吸附量(P<0.05)。HMVP-n人工血管吸附了更多的白蛋白,其中HMVP-1最为明显,具有统计学意义(P<0.05),因此显示了更好的生物相容性。修饰后的人工血管所浸泡的培养基对细胞的培养所产生的LDH的OD值要小于未修饰材料,并且随着培养基进行浸泡材料时间的延长,并没有明显的有毒物质渗出。介孔合成的人工血管未引起机体的明显的反应,植入体内没有毒性反应和全身反应,没有损害新组织的功能。符合医用生物材料的标准要求。具有良好的生物相容性。血小板粘附实验、复钙时间实验和凝血试验显示修饰的后人工血管具有良好的抗凝性和抗血小板粘附。结论：肝素固载的含介孔人工血管具有良好的生物相容性。复合生物材料的要求。第三部分固载肝素的含介孔人工血管的内皮化研究目的：体外分离纯化、扩增和鉴定、标记兔晚期内皮祖细胞(EPCs),种植合成血管后研究细胞的粘附性增殖性,研究材料的内皮化性能。方法：经兔心内采血20ml/只进行EPCs的获取,密度梯度离心法获取中间白膜层单核细胞,悬浮于EBM-2MV(含15%的胎牛血清)全培养液中,以2×106密度接种于预先包被好纤连蛋白(5μg·cm-2)的25cm2培养瓶中进行细胞培养。按照1：3传代,每天倒置相差显微镜观察细胞生长状况。经DiI-ac-LDL和FITC-UEA-I双荧光染色鉴定倒置荧光显微镜下观察。EPCs的免疫组织化学检测：EPCs按试剂盒方法检测其是否具有fik-1、vWF和CD34等内皮细胞的特异性标志。流式细胞仪进行D14,CD133,CD45,CD31,CD34表面抗原检测。鉴定后的细胞进行CM-Dil的染色标记并种植于合成的人工血管材料膜上,MTT实验检测细胞在材料上的生长活力,粘附率测定和NO分泌能力测定分析细胞在材料的粘附性和功能。通过激光共聚焦显微镜和SEM观察细胞在材料上分布形态,并模拟机体血流的生物反应,观察种植在材料上的EPCs能否经受血流的冲刷保持完整性和表面性能。结果：新分离的单个核细胞圆形透亮,培养到9-12天呈集落样生长,细胞迅速形成铺路石样排列改变。细胞在1个月培养中可传代5～7次(传代比例为1：3),具有强大的增殖性。在倒置荧光显微镜下观察：摄取ac-LDL呈红色,与UEA-I结合呈绿色;EPCs具有内皮细胞的特异性标志：fik-1、vWF和CD34。早期EPCs表型显示：CD14、CD45阳性,CD133阴性；晚期EPCs表型显示CD31、CD34阳性,CD14、CD45、CD133阴性。培养的EPCs具有成血管能力和NO分泌能力。MTT实验显示EPCs在在未修饰的ePTFE人工血管膜片上生长缓慢,而EPCs在HMBVP-n材料膜上有较快的生长增殖性能,其中HMBVP-1膜片上的细胞生长更为明显(P<0.05).EPCs在HMBVP-1,2,3的粘附率分别为73.6增加为88.8%、66.4%到81.3%、67.6%增加至75.6%。并且种植在HMBVP-n血管材料上的EPCs保持了较高的NO分泌能力。SEM和激光共聚焦荧光显微镜下可以看到EPCs整齐的排列于不同的血管材料膜上,融合成片,完整的覆盖了血管材料膜。流体剪切力下种植在HMBVP-n的EPCs保持了完整性和表面显型。结论：密度梯度离心法能有效分离和扩增兔外周血晚期EPCs,具有可操作性和可重复性。HMBVP-r促进种子细胞在材料表面的黏附增殖和维持了细胞的正常功能和形态,剪切力下能保持EPCs完整性和表面显型,固载肝素的介孔材料修饰能有效促进ePTFE的内皮化。第四部分晚期EPCs复合肝素固载的介孔人工血管兔腹主动脉移植的实验研究目的：建立兔腹主动脉-髂动脉血管旁路移植的动物模型,通过检测血管移植后的通畅率、内皮祖细胞覆盖和内膜增生情况,验证EPCs复合肝素固载的介孔人工血管作为小口径人工血管的可行性。方法：种植晚期EPCs的HMBVP-1复合血管在无菌条件下行新西兰兔腹主动脉-髂动脉旁路移植模型。实验A组：种植晚期EPCs的HMBVP-1复合血管(n=12)(试验组)；B组：种植EPCs的未修饰ePTFE小口径人工血管(n=12)(对照组)。各实验动物于术后3,15,30天,观察移植段血管通畅率,取出移植段动脉标本进行大体观察,HE、Masson染色,光镜观察血管内膜、胶原纤维、弹力纤维等情况；SEM观察实验组血管形态。移植血管30天后凝血酶失活实验判断血管表面肝素活性。结果：所有实验动物均手术成功,手术中可探查吻合口及髂动脉远端血管搏动良好。手术成功率100%。实验组动物术后3,15,30天,总出现4例实验组新西兰兔出现移植血管闭塞,其他实验兔显示移植血管彩色多普勒超声检查血流正常,无明显的严重狭窄,30天后观察移植血管标本管壁周围有组织增生,切开动脉壁见腔内内壁光滑,可见完整的内膜层结构,所有实验组移植血管通畅率为66.7%。对照组在30天的观察期间实验兔移植血管全部闭塞,动脉壁纵形剖开观察,内有大量的红色血栓阻塞血管或伴机化组织。HE染色实验组术后30天内腔有内皮细胞形成连续致密的内膜层,可清楚观察到内膜和外膜血管结构。Verhoeff-Masson染色观察：对实验组通畅的30天后的移植血管标本远端吻合口无明显内膜增生,不伴有胶原和弹力纤维的增生。凝血酶失活的肝素活性实验显示血管移植30天后仍具有强大的抗凝活性。结论：肝素固载的含介孔人工血管能够保持肝素的长期活性,具有良好的血液相容性和组织相容性,有利于血管内皮化的形成,可以应用于小口径血管的移植。
【作者】李坤；
【导师】刘长建；
【作者基本信息】南京大学，外科学，2011，博士
【关键词】介孔；膨体聚四氟乙烯；肝素；修饰；血液相容性；生物相容性；晚期内皮祖细胞；分离培养；鉴定；内皮化；血管移植；兔；

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