不同方式运动对生长期小鼠骨合成代谢和Wnt信号通路的影响

【摘要】骨的主要功能是保护内部器官和支撑身体,另外,还参与钙的代谢。骨组织在整个生命过程中都是动态变化的,受内、外环境变化的影响,其中包括遗传、生活方式和运动锻炼。运动造成的机械刺激能够调节骨的发育,影响骨生长的速率和骨的形状、大小、强度以及解剖学结构。运动锻炼能够增加骨密度,降低骨质疏松症的发生,并且对生长期骨合成代谢的影响要比老年更有效。骨量在生长期不断提高,在成熟期达到峰值,以后会随年龄增长开始降低,生长期骨量积累减少骨折发生,也能延缓骨质疏松症的发生。PTH和CT在骨代谢中起到主要作用,这两种激素已被美国食品与药品管理局(FDA)批准在临床上用来治疗骨质疏松。运动对骨合成代谢的影响是否通过诱导内源性PTH和CT浓度升高进行调控；Wnt信号通路是调节骨代谢的主要信号通路,PTH和CT是否通过Wnt信号通路调节骨形成,这些机制尚未得到证实。目的：观察下坡跑台运动、平坡跑台运动和游泳运动对骨密度、骨矿含量和骨组织骨合成代谢相关细胞因子基因及蛋白表达的影响,检测8周运动后原代MSCs增殖和分化差别,寻求对骨合成代谢影响更为显著的运动方式。对比不同方式运动对小鼠血清PTH和CT浓度影响,体外PTH和CT浓度变化对成骨细胞增殖和分化的影响,研究不同方式运动诱导内源性PTH和CT浓度变化对骨合成代谢产生影响,探讨不同方式运动健骨机制,丰富运动健骨的理论知识,为骨代谢疾病的治疗寻找合适的靶点。方法：C57BL/6小鼠120只,分4组,下坡跑台组(DT组)、平坡跑台组(T组)、游泳组(S组)、安静对照组(C组),每组30只。训练方案为：DT组训练,跑速均为0.8km/h,坡度分别为-9°；T组跑速与DT组相同,坡度为0°；S组游泳训练,不负重,漂浮不动时用毛刷驱赶。即刻运动组在一次运动后处死,运动时间40min,Elisa法测血清PTH和CT浓度,qRT-PCR法测甲状腺PTH、CT和Destrin基因表达。长期运动组每次训练40分钟,每周训练5次,共训练8周,用Elisa法测运动后即刻和运动后休息24小时血清PTH和CT浓度,用双能X射线测肱骨远端骨密度,原子吸收法测胫骨骨矿含量,qRT-PCR检测胫骨ALP、OCN、Runx2、RANKL、Destrin、PTH1R、CTR、Fz、DVL、LRP5/LRP6、β-catenin、JNK、ROCK、NLK、NFAT、Bax和Bc12基因表达。8周训练后,4组小鼠分别取原代MSCs体外培养,结晶紫染色检测MSCs增殖；诱导分化后ALP染色法检测成骨细胞ALP活性,VonKossa染色检测成骨细胞矿化能力,qRT-PCR测相关基因表达,WesternBlot法测相关蛋白表达,以检测运动对原代MSCs细胞影响的效果在体外培养过程中是否能够持续存在。在MSCs细胞培养过程中添加PTH和CT,分为4组,P+C组两种激素同时添加,P组只添加PTH,C组只添加CT,O组为对照组,不添加激素,MTS法检测MSCs细胞增殖情况,诱导分化后ALP染色法检测成骨细胞ALP活性,VonKossa染色检测成骨细胞矿化能力,qRT-PCR测相关基因表达,WesternBlot法测相关蛋白表达,以检测PTH和CT对MSCs增殖和分化的影响。结果：(1)跑台运动和游泳运动对生长期小鼠体重没有显著影响(P>0.05)；游泳运动和跑台运动都提高了生长期小鼠肱骨骨密度(P<0.05),提高了胫骨骨矿含量,并且下坡跑台运动效果更显著(P<0.01)。不同方式运动对胫骨Runx2、Destr1R、CTR、Fz、DVL、β-catenin、ROCK、JNK、Bcl-2和Bax这11种基因的表达产生显著影响(P<0.05)；跑台运动和游泳运动运动后胫骨Destrin、Fz和DVL基因表达有一致性变化,相对于对照组有上调趋势,另外8种基因表达受运动方式影响较显著。(2)DT组原代MSCs增殖优于T组和S组(P<0.01)；T组和S组成骨细胞ALP活性要优于DT组；成骨细胞骨矿化能力不同,T组>DT组>S组>C组。(3)不同方式运动后,3个运动组原代MSCs诱导分化的成骨细胞Fz、DVL和RANKL基因表达显著上调(P<0.05),OCN基因表达显著下调(P<0.05)。另外,DT组原代MSCs诱导分化的成骨细胞CTR、LRP5、ROCK和Destrin基因表达显著上调(P<0.05),ALP基因表达显著下调(P<0.05)；S组原代MSCs诱导分化的成骨细胞CTR和ROCK基因表达显著上调(P<0.05)。PTHIR、CTR和RANKL蛋白表达跟基因表达趋势相同,而β-catenin蛋白表达与基因表达不同。(4)一次训练后即刻和8周训练后即刻,不同方式运动导致小鼠血清PTH和CT浓度呈现非常显著性差异(P<0.01),在8周训练休息24小时后,不同方式运动对小鼠血清PTH和CT浓度变化没有显著影响。一次训练后即刻,DT组小鼠血清PTH和CT浓度显著升高(P<0.05)；8周训练后即刻,S组小鼠血清PTH浓度显著降低(P<0.01),DT组和T组小鼠血清CT浓度都显著升高(P<0.01),其中DT组小鼠血清浓度升高最为显著。一次不同方式运动对小鼠甲状腺CT和Destrin基因表达产生显著影响(P<0.05)。(5)P组MSCs增殖能力强于C组和O组(P<0.05),P+C组和C组成骨细胞ALP活性优于P组和O组,C组成骨细胞矿化能力强于其他3组。(6)P+C组和C组PTH1R基因表达相对于另外两组显著上调(P<0.01)；相对O组,P+C组、P组和C组CTR基因表达都显著上调(P<0.05)。P组和C组成骨细胞相对于其他两组Fz基因表达显著上调(P<0.05)；激素干预的3组LRP5基因表达都显著上调(P<0.05),P+C组>P组>C组。激素干预后成骨细胞表达DVL基因也显著上调(P<0.05)；P+C组成骨细胞Wnt信号通路效应蛋白β-catenin、ROCK、JNK和NFAT基因表达相对于P组或者C组都有显著下调趋势；C组的ROCK和NFAT基因相对于其他几组显著上调(P<0.05)。PTH和CT浓度升高后,成骨细胞Marker基因ALP、OCN和RANKL表达出现显著差异(P<0.05),P+C组和C组ALP和RANKL基因表达显著上调(P<0.01),P+C组和P组OCN基因表达显著下调(P<0.01),C组Runx2基因表达显著上调(P<0.05)。结论：(1)跑台运动和游泳运动对生长期小鼠体重没有影响,但是能够显著增强生长期小鼠骨密度,并且下坡跑台运动对生长期小鼠骨密度和骨矿含量的提高更为有效。(2)骨组织基因表达结果显示,跑台运动主要通过抑制Wnt/PCP信号通路的效应蛋白ROCK和JNK基因表达,促进骨合成代谢。不同方式运动能够诱导Destrin基因表达上调,并且上调幅度跟重力负荷相关,表明Destrin基因对力学刺激敏感。(3)不同方式运动会对生长期小鼠血清PTH和CT浓度产生显著影响,下坡跑台运动能够显著提高血清PTH和CT浓度,平坡跑台运动也能提高血清PTH和CT浓度,效果没有下坡跑台显著,游泳运动不能有效促进血清PTH和CT浓度的提高。表明跑台运动能够通过提高内源性PTH和CT浓度进而促进骨合成代谢。(4)在体外细胞培养实验中,单独添加PTH促进MSCs细胞增殖效果最明显,单独添加CT有效促进成骨细胞活性和骨矿沉积,同时添加PTH和CT能促进受体蛋白PTHIR和CTR表达,促进经典Wnt信号通路受体蛋白LRP5的基因表达和经典Wnt信号通路效应蛋白β-catenin蛋白表达,增加骨矿沉积。另外,单独添加CT促进Wnt/Ca2+信号通路NFAT基因表达。(5)PTH和CT浓度变化对成骨细胞Marker基因表达产生不同影响。CT浓度升高促进ALP、RANKL和Runx2基因表达上调,提高成骨细胞活性。PTH浓度升高诱导成骨细胞OCN基因表达显著下调,促进骨合成。
【作者】杨念恩；
【导师】李世昌；
【作者基本信息】华东师范大学，运动人体科学，2014，博士
【关键词】下坡跑；游泳；成骨细胞；骨合成；骨密度；甲状旁腺激素；降钙素；Wnt信号通路；

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