检测分子间相互作用的NMR新方法研究

【摘要】相互作用广泛存在于生物大分子与生物大分子之间以及生物大分子与配体小分子之间。生物分子通过分子间相互作用发挥功能,对分子间相互作用的检测与识别是药物筛选和设计的重要环节。核磁共振(NuclearMagneticResonance,NMR)波谱学在检测和识别分子间相互作用方面有许多优势,例如,能够在近生理条件下提供达到原子分辨率的生物分子结构与动力学信息,以及结合常数等定量信息。按照检测对象的不同,检测分子间相互作用的NMR方法可以分为两类：(1)以配体小分子为检测对象；(2)以生物大分子为检测对象。以生物大分子为检测对象的NMR方法可以获得结合位点的结构与动力学信息,对药物的设计有非常重要的意义,但往往需要对生物大分子进行同位素标记,使得样品制备和数据处理变得更为复杂。以配体小分子为检测对象的NMR方法,虽然不能提供有关受体的结构信息,但是仅需要少量的非同位素标记的生物大分子,即可快速的筛选药物先导化合物。本文旨在针对一些现有相互作用检测技术操作复杂和灵敏度低等问题,发展新的检测分子间相互作用的NMR方法,以简化其操作,提高其灵敏度,具体包括：1、建立了基于辐射阻尼(RadiationDamping,RD)的生物大分子的配体筛选技术RD-WaterLOGSY:WaterLOGSY是目前最常用NMR配体筛选技术之一。该技术通过对水的磁化矢量的选择性激发,进而依靠水、蛋白、配体三者之间的化学交换和NOE效应将水的磁化矢量传递到配体小分子,实现与生物大分子有相互作用的配体小分子的快速选择性检测。水的选择性激发需要使用频率选择性脉冲来实现,如形状脉冲或者组合脉冲串等,实验设置复杂,特定频率范围的激发需要对形状脉冲的功率和脉宽进行准确的优化,技巧性较高,且所需选择性脉冲宽度越长,信号损失越严重。辐射阻尼是高强度NMR信号所特有的物理现象,在生物大分子水溶液中,仅有水磁化具有辐射阻尼现象,因此可将其用于水的选择性调控。我们利用辐射阻尼效应来实现水信号的选择性激发,从而建立了RD-WaterLOGSY方法。实验结果表明,该方法简单易用,具有普适性,甚至非NMR专业人员也可使用；灵敏度高,可以有效地提高药物筛选的效率；易于扩展,可方便地与各类多维NMR实验技术以及谱编辑技术相结合,有效地排除干扰信息,指认配体,获得相互作用的信息。2、使用1H-14N异核相关谱研究天然丰度赖氨酸三甲基修饰蛋白质的构象转变及相互作用：以生物大分子为检测对象的NMR方法往往需要对生物大分子进行13C、15N等同位素标记,但是样品的制备和数据处理复杂。14N同位素天然丰度高,但极强的四极弛豫(自旋量子数I=1)使其无法检测。研究表明,三甲基化14N由于电子云的对称性增加,四极作用大大减小,可选择性检测。我们将1H-14N异核相关谱应用于三甲基修饰蛋白质的构象变化及相互作用：研究天然丰度细胞色素C蛋白质随着pH变化的构象转变过程,观测了吡啶与细胞色素C的相互作用。1H-14N相关谱能够有效地简化谱图,是一种有潜力的可以在天然丰度下研究真核体系中广泛存在的三甲基修饰蛋白质的构象转变与相互作用的NMR方法。3、把1H-14N相关谱用于蛋白质侧链赖氨酸三甲基修饰的检测：我们以重组表达的GB1为对象,使用碘甲烷实现了蛋白质侧链赖氨酸的三甲基修饰,用1H-14N相关谱检测修饰的程度及其对结构的影响。结果表明,GB1的6个赖氨酸侧链均得到了有效的三甲基修饰,且该修饰没有影响GB1的三维结构。因此,1H-14N相关谱可以用于在天然丰度下鉴定蛋白质的三甲基修饰情况,甚至用于结构、相互作用和动力学研究。
【作者】孙鹏；
【导师】张许；刘买利；
【作者基本信息】中国科学院研究生院（武汉物理与数学研究所），分析化学，2014，博士
【关键词】分子间相互作用；RD-WaterLOGSY；1H-14N异核相关谱；构象转变；甲基化；

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