番茄抗晚疫病基因Ph-3的克隆及其效应子的筛选

【摘要】晚疫病由卵菌纲致病疫霉（Phytophthorainfestans（Mont.）deBary）引起，是全球范围的病害，主要影响马铃薯和番茄的生产。近年来，已克隆了多个马铃薯抗晚疫病的基因，但番茄晚疫病的研究相对滞后。在番茄抗病育种中，最常用的抗晚疫病基因是Ph-3。在之前的研究中，Ph-3基因已经被定为到番茄9号染色体长臂末端74kb的区间，该区域包括8个开放阅读框，其中4个编码CC-NBS-LRR类植物抗病基因。在此基础上，本研究通过图位克隆的方法克隆了首个番茄抗晚疫病R基因Ph-3，并通过效应子组学对其所识别的效应子进行了筛选，旨在为番茄抗晚疫病育种和抗病机理研究提供参考。全文的主要结果如下：1.根据番茄参考基因组Heinz1706，选取Ph-3基因所在区域不同RGA之间相对保守的两个片段构建沉默载体。通过VIGS技术在含有Ph-3基因的番茄材料CLN2037B中沉默候选R基因家族，结果显示CLN2037B由抗病变为感病，表明Ph-3基因属于CC-NBS-LRR类抗病基因。2.通过筛选约1900个F2或F3植株获得7个重组单株，对这些重组单株进行表型和基因型分析，进一步将Ph-3基因定位到26kb的区间，侧翼标记为R2M1S和M67-3。根据番茄参考基因注释信息，该区间含有3个CC-NBS-LRR类抗病基因。3.利用Ph-3基因的供体材料醋栗番茄L3708构建了BAC文库，从中筛选到覆盖Ph-3区域的单克隆B25E21。然后对该克隆进行全长测序，并将其与番茄参考基因组的对应序列进行比对发现，在L3708中Ph-3基因所在的区域存在一个约28kb的缺失，该缺失导致RGA数目的减少。在Ph-3基因对应的区域，Heinz1706中含有4个RGA，而在L3708中仅含有2个RGA。在侧翼标记R2M1S和M67-3之间，L3708中仅含有一个RGA，命名为SpRGA2。随后，通过转基因的方法对SpRGA2进行功能验证。在14个转SpRGA2的Moneymaker植株中，9株表现为抗病，因此证明SpRGA2即为Ph-3基因。4.番茄抗晚疫病基因Ph-3的全长为2556个核苷酸，编码851个氨基酸的蛋白质。预测的Ph-3蛋白属于CC-NBS-LRR类植物抗病蛋白。5.在已经克隆的马铃薯抗晚疫病基因中，Ph-3基因和同样来自9号染色体上的三个基因Rpi-vnt1、Rpi-mcq1和R9a具有较高的氨基酸一致性。但是，这些抗病蛋白在LRR结构域的一致性较低。另外，Ph-3与位于番茄9号染色体着丝粒附近的抗番茄花叶病毒基因Tm-22也具有较高的一致性。对已克隆的抗晚疫病R基因进行进化树分析发现，来自9号染色体的所有抗晚疫病R基因（Ph-3、Rpi-vnt1.1、Rpi-vnt1.2、Rpi-vnt1.3、Rpi-mcq1和R9a）都属于Tm-22类抗病基因，与其它抗晚疫病基因的距离较远。6.利用农杆菌注射法，在烟草中筛选了约240个效应子，发现一个效应子PITG09218在与Ph-3共注射后，能在烟草叶片上引起HR反应或叶片失绿。随后，用PVX侵染法，在含有Ph-3基因的野生醋栗番茄L3708中对PITG09218进行分析，发现在接种部位PITG09218能够引起细胞坏死。初步确定，效应子PITG09218能被Ph-3基因识别。7.分析了51份马铃薯晚疫病菌生理小种对两个番茄材料CLN2037B和Moneymaker的侵染能力。通过比较病斑面积和孢子囊产量发现，番茄对这些马铃薯晚疫病菌具有非寄主抗性。8.将Ph-3基因转化到感病马铃薯品种Desiree中，获得11个阳性转化株。采用离体叶片接种法鉴定发现，转Ph-3基因的Desiree对晚疫病菌生理小种CA-65、IPO-C、EC-1和3928-A表现为感病，说明这些生理小种都不含有Ph-3基因对应的效应子。
【作者】张春芝；
【导师】杜永臣；
【作者基本信息】中国农业科学院，蔬菜学，2014，博士
【关键词】番茄；晚疫病；Ph-3；效应子；非寄主抗性；

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