沙冬青胁迫应答基因AmHP40的克隆和功能分析

【摘要】通常在自然生长条件下,由干旱、盐碱、低温以及高温引起的非生物胁迫是植物最严重的环境胁迫之一。植物通过激活一系列编码应激蛋白的基因来灵敏应对这些非生物胁迫。沙冬青对于中国西北极端干旱,高温和土壤贫瘠的沙漠地区的环境具有很好的耐受性,这为开展非生物胁迫耐受机制的研究提供了良好的植物材料。本研究从沙冬青中克隆并鉴定新的功能基因,旨在为抗逆育种提供新的遗传资源。结果如下：1.AmHP40的遗传特性。利用cDNA-AFLP和RACE-PCR技术分离了一个胁迫应答沙冬青的基因,该基因包含一个长度为321bp的开放阅读框(ORF)。通过NCBI中BLAST分析发现,该ORF编码一个含有106个氨基酸残基的AmHP40蛋白。序列同源分析表明,与其相似性最高的同源序列也是一个功能未知的预测蛋白。AmHP40包含一个从Metl到Arg10的典型的未知功能域(MWHLIAAVRR),无跨膜结构域。此外,AmHP40蛋白可能属于可溶性蛋白,其二级结构包括螺旋、转角,β折叠在螺旋中很少而在转角中分布很多。我们进一步发现,AmHP40融合GFP标记主要分布于拟南芥原生质体细胞质。此外,AmHP40的表达受盐、冰冻、高温、干旱和赤霉酸强烈诱导。2.过表达和转基因植物的生理特性。将AmHP40构建到pBI121的表达载体中,并转化到拟南芥。Westernblot分析表明AmHP40基因已整合到拟南芥基因组中。GUS信号检测显示AmHP40基因在转基因拟南芥的叶片,茎,长角果,和根组织中强烈表达。转基因拟南芥生长正常,没有矮化表型的变化。有趣的是,在将植株转入土壤中后,转基因植物比野生型植物约提早1周开花。3.非生物胁迫耐受性分析。通过分析转基因植株和野生型植株在种子萌发,幼苗和成株这三个发育阶段的耐受能力发现,转基因拟南芥对非生物胁迫表现出更强的耐受性。将转基因植株和野生植株的种子分别播种在含有100mM的盐和300mM甘露醇的培养基上,转基因种子的萌发率更高。在100mM氯化钠(盐)、300mM甘露醇(干旱)、-20℃放置1小时(冻结)或45。C放置1小时(高温)这些不同的处理下,转基因幼苗在根长和干重这两个指标受到的影响要比野生型的小。而在正常培养条件下,转基因幼苗的根长明显短于野生型幼苗。此外,在100mM氯化钠处理条件下,转基因幼苗的叶绿素a,叶绿素b和总叶绿素含量都高于野生型幼苗,在45。C处理4小时、-20℃处理4小时,继而4℃处理2小时以及停止浇水10天的条件下,转基因幼苗的新叶数量都高于野生型幼苗。而且,我们发现在盐、低温及高温条件下,转基因幼苗的可溶性蛋白的积累显著提高。4.在非生物胁迫应答途径的标记基因的表达。在盐、干旱、低温及高温条件下,的转录水平均发生了改变,说明AmHP40参与了干旱耐受性的调控途径。我们的数据表明,AmHP40基因是通过积累具有渗透保护作用的AmHP40蛋白来改善植株对盐,干旱,低温及高温的耐受性。AmHP40可以作为靶基因用于提高重要农作物对非生物胁迫的耐受性。5.AmDUF1517上游区的缺失分析。1,026bp的AmDUF1517的启动子序列中含有应答非生物胁迫和植物激素的顺试作用元件。为鉴定该功能区域,将部分删除的启动子和reportgene融合构建到pGI4表达载体中,共构建了7个质粒。
【作者】PimpanPimonrat；
【导师】程红梅；
【作者基本信息】中国农业科学院，生物化学与分子生物学，2014，博士
【关键词】非生物胁迫耐受性；沙冬青；AmHP40基因；植物启动子；AmDUF1517；

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