中和抗体结合MCP-1对狂犬病暴露后预防研究及嵌合糖蛋白重组狂犬病病毒的构建

【摘要】狂犬病是一种致死性的中枢神经嗜性的人兽共患传染病，病原是狂犬病病毒，能感染人和所有温血动物。据世界卫生组织（WHO）报道，每年造成全世界大约26,000~55,000人的死亡，其中绝大多数发生于非洲和亚洲的发展中国家，对人类的公共卫生一直存在着威胁。在亚洲、非洲和拉丁美洲，犬源的狂犬病毒是人类感染狂犬病的主要来源。在美国，犬源的狂犬病通过宠物免疫计划得到控制，而来源于蝙蝠等野生动物感染是引起人狂犬病的主要原因。目前暴露后预防（PEP）主要包括接种疫苗和抗狂犬病免疫球蛋白等措施，尽管许多报道表明一旦出现神经症状，狂犬病是没有办法治疗的。但是如果在暴露后能够及时采取PEP措施，使外周免疫效应因子和抗体进入中枢神经，动物感染病毒后即使到达了脑部，还是可以有效阻止狂犬病的发生。尽管有通过昏迷疗法（MilwaukeeProtocol）及其衍生法治疗狂犬病的案例，但该方法的有效性一直存在质疑。我们以前的研究表明，表达GM-CSF等免疫刺激因子的重组狂犬病毒（rRABVs）可通过激活、聚集树突状细胞（Dendriticcells，DCs），在中枢神经系统（CNS）诱导表达高水平的趋化因子及细胞因子，增强血脑屏障（BBB）通透性，提高中和抗体（VNA）水平，进而消除CNS中的病毒，致使避免街毒株狂犬病感染的发生；同时MCP-1增强BBB通透性后提高了灭活重组病毒对街毒感染的治疗效果，因此中和抗体与BBB通透性的增强是狂犬病暴露后有效预防的主要因素。为了研究狂犬病病毒中和抗体结合MCP-1对小鼠暴露狂犬病街毒后的预防效果，在ICR小鼠肌肉感染10IMLD50狂犬病街毒株DRV后不同时间点，以静脉注射（i.v.）中和抗体和（或）脑内接种（i.c.）单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）进行处理。结果发现，在感染街毒后3d和5d开始处理，中和抗体结合MCP-1的方法均具有显著的保护作用。通过病毒滴定、组织切片、免疫组化等方法检测存活和死亡小鼠脑内的病毒含量，发现存活小鼠中检测不到病毒，死亡小鼠脑内检测到较高的病毒滴度；通过中和实验与ELISA方法检测抗体水平发现，存活小鼠脑内检测到显著升高的中和抗体与IgG水平，死亡小鼠脑内检测不到中和抗体与检测到较低的IgG水平。数据说明，中和抗体结合MCP-1的方法能成功地清除小鼠CNS中的病毒，从而阻止狂犬病感染的发生。由于存活的ICR小鼠脑内检测到较高水平的κ轻链mRNA水平（代表B细胞数量），为了研究B细胞在小鼠狂犬病暴露后预防中的作用，我们选取B细胞敲除的C57BL/6J小鼠复制ICR小鼠的实验。在B细胞缺失小鼠肌肉感染DRV后，用中和抗体和MCP-1进行处理。结果发现，小鼠感染后5d开始处理的存活率只有25%，而在5d和7d重复注射MCP-1后的存活率上升到75%。在存活小鼠中检测到显著升高的中和抗体与较高的IgG水平，而检测不到狂犬病病毒；相反在死亡小鼠脑内检测到较高的病毒滴度，而检测不到中和抗体。在存活B细胞敲除小鼠脑内检测不到κ轻链mRNA水平，说明即使在没有分泌抗体B细胞的情况下，只要BBB通透性持续增强，足够的中和抗体进入CNS，中和抗体结合MCP-1的方法就能成功地清除B细胞缺失小鼠CNS中的病毒，从而阻止小鼠感染狂犬病。为了研究中和抗体结合MCP-1对狂犬病暴露后预防的保护机制，我们分成未感染与感染DRV两种情况进行探讨。在未感染DRV情况下，中和抗体与MCP-1同时处理后ICR小鼠脑内检测到显著升高的中和抗体，单独处理中和抗体组小鼠脑内检测不到中和抗体水平，说明MCP-1使BBB通透性增高，外周的VNA进入脑组织中，使脑内的中和抗体显著升高；在感染DRV情况下，发现MCP-1处理后脑内BBB通透性在12h后开始上升，36h时达到峰值，处理48h后开始下降，逐渐恢复正常水平，与之前的报道保持一致的趋势。而紧密连接分子（Occludin、Claudin-5和ZO-1）表达量随着NaF吸收量的增加而下调，脑内中和抗体水平随着BBB通透性的升高而增高，病毒含量随着中和抗体水平的升高而降低。这些结果说明，中和抗体结合MCP-1的方法利用MCP-1增强BBB通透性的功能，允许外周的中和抗体进入CNS中，从而达到清除病毒，阻止狂犬病发生的目的，再一次证实了中和抗体与BBB通透性对清除CNS中病毒的必要性。研究表明，狂犬病病毒的G蛋白表达量与致病性呈负相关，而强弱毒株（B2C和DRV）G蛋白的表达量存在差异。为了研究G蛋白的跨膜区、膜内区与G蛋白表达量及病毒致病力的相关性，我们利用实验室构建的B2C反向遗传系统，将DRVG蛋白跨膜区（TM）和膜内区（CT）替换B2CG蛋白的相对应区域，成功拯救嵌合病毒并命名为rB2C-(DRV-TM+CT)、rB2C-(DRV-CT)和rB2C-(DRV-TM)，构建的嵌合病毒与母本病毒具有相似的复制和增殖水平，关于嵌合病毒G蛋白的表达量及其与病毒致病性的相关性还有待进一步的研究。综上所述，只要BBB的通透性持续增高，中和抗体结合MCP-1的方法能够有效的阻止免疫系统完善或B细胞缺陷的小鼠暴露狂犬病后疾病的发生。
【作者】李真光；
【导师】武华；ZhenF.Fu；
【作者基本信息】中国农业科学院，预防兽医学，2014，博士
【关键词】狂犬病病毒；狂犬病治疗；病毒中和抗体；暴露后预防；嵌合病毒；

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