猪带绦虫基因组和转录组测序及Wnt基因家族的分析研究

【摘要】猪带绦虫(Taeniasolium)是扁形动物门寄生虫。成虫仅寄生于人体肠道；幼虫则寄生在人或猪的脑、眼和肌肉等组织,引起囊尾蚴病。人脑囊尾蚴病常导致患者出现癫痫等中枢神经系统病症,重则致死。该病呈世界性分布,在中美洲、拉丁美洲、东南亚及非洲环撒哈拉沙漠的一些落后国家和地区广泛流行。该病主要在我国西南等省的部分落后地区流行,直接威胁着食品安全和人民健康。目前,猪带绦虫的基础研究还相对滞后,使其应用研究也遇到一定的困难。我们期待通过基因组测序,从分子水平上揭示猪带绦虫的相关科学问题。本研究利用454和Solexa测序技术相结合的方法,对猪带绦虫进行了全基因组从头测序,获得了高质量和高覆盖度的基因组草图,测序覆盖度达45x,基因组大小为131Mb。注释出11,902个基因。此外,还利用Solexa的RNA测序技术,对经人工肠液激活和未激活的猪囊尾蚴进行了转录组测序。共鉴定出2,766个差异表达基因,其中在激活猪囊尾蚴时期转录上调的基因有1,904个,下调的基因有862个。进一步分析这些差异的基因,发现有68.8%的基因表达明显上调,有31.2%的基因则明显下调。其中,Wnt基因家族及其信号途径变化明显,通过注释发现猪带绦虫Wnt基因家族共有6个成员,Wnt4和Wnt11b在激活后表达明显上调。通过RT-PCR、5’-和3’-RACE克隆获得猪带绦虫Wnt家族基因。Wntl长3,316bp,存在可变剪接形成两种转录本Wntl-1ORF框为1,599bp,由6个外显子组成；Wnt1-2ORF框为1,515bp,由5个外显子组成：Wnt2长21,355bp,ORF框为1,746bp,由6个外显子组成：Wnt4长10,741bp,在5’端也存在不同的剪切形式,但它们的ORF框完全相同,均为1,473bp,由4个外显子组成；Wnt5长12,272bp,ORF框为1,095bp,由5个外显子组成；Wnt11a长3,746bp,ORF框为1,263bp,由6个外显子组成；Wnt11b长14,537bp,ORF框为1,608bp,由6个外显子组成。生物信息学分析发现,猪带绦虫Wnt基因均有信号肽和二硫键,存在多个保守的半胱氨酸、天冬酰胺和甘氨酸位点,具有N-糖基化、磷酸化和N-豆蔻酰化修饰。利用不同物种的Wnt氨基酸序列构建系统进化树发现,扁形动物寄生虫Wntl与其他物种的Wntl不能聚类,而是被单独分为一群,Wnt2、Wnt4、Wnt5、Wnt11a和Wnt11b则在物种进化的过程中较为保守,且扁形动物寄生虫在进化过程中,Wnt家族基因发生了丢失,这种变化可能是寄生虫高度适应寄生生活的结果。筛选确定GAPDH为内参基因,以激活前后的猪囊尾蚴为样本,通过相对定量qPCR实验,发现猪囊尾蚴被激活后,Wnt4和Wnt11b及Wnt经典途径的靶分子LEF1和非经典途径的靶分子NFAT都明显上调,结果与转录组测序结果一致。我们在体外合成了Wnt4cRNA探针,对激活前后的猪囊尾蚴进行RNA原位杂交检测,在激活的猪囊尾蚴尾部检测到Wnt4mRNA信号,推测Wnt4可能通过调控Wnt经典信号途径参与了猪带绦虫幼虫向成虫发育过程中体节的分化。
【作者】侯俊玲；
【导师】才学鹏；
【作者基本信息】中国农业科学院，预防兽医学，2014，博士
【关键词】猪带绦虫；基因组；转录组；Wnt基因家族；

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