紫花苜蓿MsZFN及拟南芥HST基因鉴定

【摘要】本文以紫花苜蓿和拟南芥为研究对象，主要利用基因工程、转基因技术和表型分析，分析MsZFN和HST的功能。主要试验结果如下：1.通过PCR扩增获得了MsZFN基因gDNA（登陆号：JX131368）全长6829-bp，cDNA全长1667-bp，含有七个外显子，六个内含子,六个内含子长度分别为：820-bp，494-bp，1825-bp，286-bp，641-bp和1093-bp。2.采用RT-PCR和qRT-PCR的方法，分析MsZFN基因的表达特征。RT-PCR方法显示，MsZFN在所选的组织中（包括根，茎，叶，花）均有表达，但在叶片中表达量最高，花中表达量较低，尤其是花芽中表达量最低；MsZFN基因受黑暗诱导，随着黑暗时间延长，表达量升高。在有20μMABA，20μM赤霉素等激素诱导条件下，MsZFN基因表达量没有明显差异，在冷处理条件下，MsZFN基因表达量，没有明显的变化。3.将MsZFN基因编码区插入pCAMBIA1302中，构建双元表达载体35S::MsZFN，并采用农杆菌介导的方法，成功获得拟南芥和烟草转基因植株。结果显示在拟南芥和烟草中过量表达MsZFN基因，能够明显推迟拟南芥和烟草的开花时间。4.发现一株拟南芥转基因突变体，表型为：白化苗，植株矮小，叶片很小，叶柄较短，没有分枝，腺毛较少，能抽薹，但是不能形成正常的花器官，植株高度败育，但开花时间提前。通过电子透射显微镜（TEM）和电子扫描显微镜（SEM）得知：突变体不能形成正常的叶绿体结构；叶片腺毛分枝由正常的三个，变为了两个；突变体气孔开放程度较大，气孔不能正常关闭。5.通过TAIL-PCR，发现：该突变体由于T-DNA插入导致的，插入位置在HST基因（At3g11945）的第二个内含子内。将拟南芥HST基因，导入突变体中，能够使突变体性状回复。通过RNAi方法获得HST基因低表达水平的转基因拟南芥植株。6.通过实时定量PCR和启动子表达分析，得知：该基因在绿色组织中表达量较高，随着叶片的衰老，基因表达量降低。7.通过ELISA测试，得知：该突变体脱落酸，赤霉素和玉米素水平严重下降，但赤霉素与ABA比值提高；植物生长素（IAA）水平提高。
【作者】晁跃辉；
【导师】杨青川；
【作者基本信息】中国农业科学院，草业科学，2014，博士
【关键词】紫花苜蓿；锌指蛋白；MsZFN；开花；拟南芥；HST；

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