TLR2介导TB10.4激活RAW264.7通路及细胞因子表达的研究

【摘要】牛分枝杆菌的主要宿主细胞是巨噬细胞，该菌入侵机体后通过TLR传递分子信号激活丝裂原蛋白激酶（MAPK），最终激活核转录因子（NF-κB），激活巨噬细胞免疫应答的关键分子，上调IL-1、IL-6和TNF-等炎症因子的转录和表达，激活机体的先天免疫应答。为探讨TB10.4是否通过TLR调控炎症反应及相关信号通路的信号转导，本研究开展了以下工作：首先通过ELISA检测rTB10.4对RAW264.7细胞TNF-.、IL-6和IL-12p40细胞因子表达的影响，结果显示rTB10.4能够显著激活TNF-、IL-6和IL-12p40的表达，并且呈剂量依赖关系。采用TLR2和TLR4的抗体对RAW264.7细胞进行预处理，结果显示TLR2抗体可以显著抑制rTB10.4诱导RAW264.7细胞表达TNF-、IL-6和IL-12p40，而TLR4抗体无此抑制作用。表明rTB10.4诱导RAW264.7细胞产生TNF、IL-6和IL-12p40可能是依赖TLR2通路传递信号。采用WesternBlot和量化流式细胞分析仪检测rTB10.4诱导细胞因子的表达是否与MAPK信号通路的激活有关，结果显示，rTB10.4能够诱导RAW264.7细胞激活p38和ERK1/2信号通路，并且诱导RAW264.7细胞发生明显的p38及ERK核转位；但rTB10.4不能激活RAW264.7细胞中JNK信号通路磷酸化。通过使用TLR-2及TLR-4抗体预处理RAW264.7细胞，评估rTB10.4激活RAW264.7细胞中p38和ERK1/2磷酸化是否通过TLR2和TLR4信号通路，结果显示TLR-2抗体显著降低rTB10.4诱导的p38和ERK1/2磷酸化；p38激酶的特异性抑制剂SB203580和MAPK激酶1/2特异性抑制剂U0126能够显著抑制rTB10.4诱导RAW264.7细胞分泌TNF-、IL-6和IL-12p40细胞因子。进一步采用NF-κB荧光素酶报告系统、WesternBlot和量化流式分析仪检测rTB10.4诱导细胞因子的表达是否依赖NF-κB信号通路，结果表明rTB10.4在刺激RAW264.7细胞后12h和24h能显著激活NF-κB，并通过诱导IκB的降解激活p65的磷酸化，诱导RAW264.7细胞中NF-κBp65发生明显核转位。NF-κB特异性抑制剂BAY11-7082作用结果表明：rTB10.4蛋白刺激RAW264.7细胞分泌表达TNF-、IL-12p40和IL-6依赖NF-κB信号通路。综上所述，本研究首次研究发现了rTB10.4能够上调RAW264.7细胞TNF-、IL-6和IL-12p40的表达，并且这一过程是通过TLR2受体介导p38MAPK、ERK1/2和NF-κB信号通路实现。该研究为牛结核病感染与诊断提供了分子基础，并且对理解牛分枝杆菌与宿主细胞的相互作用及分子机制提供新的研究思路。
【作者】刘淑清；
【导师】朱鸿飞；
【作者基本信息】中国农业科学院，预防兽医学，2014，博士
【关键词】重组蛋白TB10.4；牛分枝杆菌；MAPK；NF-κB；TLR2.；

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